第二阶段ε-紫红霉酮和TDP-L-柔红糖胺(TDPL-daunosamine)进行糖苷化反应得到紫红霉素 D(rhodomycin D)。催化该反应和形成TDP-L-柔 红糖胺的酶由dnm系列基因编码(见图2)。合成
起始物1-磷酸D-葡萄糖首先在dnmL编码的胸苷 转移酶作用下生成胸苷二磷酸活化的D-葡萄糖， 接着在TDP-葡萄糖-4,6-脱水酶作用下生成中间产 物TDP-4-酮基-6-脱氧-D-葡萄糖，经C2-脱氧酶及 DnmQ和DnmZ协同作用[21, 22]，再经转氨、甲基异 构及酮基还原，合成产物TDP-L-柔红糖胺。DnmS 为糖苷转移酶，负责将第一阶段合成的ε-紫红霉酮 与第二阶段合成的柔红糖胺连接在一起，生成紫红 霉素D。
收稿日期：2006-12-01 作者简介：胡又佳(1970)，男，2004年在上海医药工业研究院获得 博士学位，研究员，从事微生物药物和基因工程的研究。 Tel：021-55514600×810 E-mail：bebydou@
1 代谢工程的应用 代谢工程的应用最初体现在增加生物关键基因
蒽环类抗生素作为广谱抗肿瘤抗生素，临床主 要用于急性淋巴细胞或粒细胞白血病、神经母细胞 瘤、横纹肌肉瘤的治疗，对各种实体瘤、脑瘤、血 管瘤也有不同程度的缓解作用。其代表品种为柔红 霉素(daunorubicin)和多柔比星(doxorubicin)，后 者是前者C-14羟化衍生物，相同剂量时后者的疗效 更强、不良反应更少、抗肿瘤谱也更广，且无交叉 耐药性，上述特性使其具有更高的应用价值[16]。 表柔比星为Arcamone等[17]于1975年通过半合成获 得，与多柔比星的区别仅在于氨基糖部分4'位的羟 基构型不同，但这种立体结构的细微变化即导致 其心脏、骨髓毒性明显降低。目前工业生产中多柔 比星、表柔比星皆由柔红霉素半合成而来，随着对 柔红霉素、多柔比星的生物合成途径不断了解，利 用代谢工程来提高柔红霉素的发酵产量仍具重要意 义，甚至通过发酵直接生产多柔比星、表柔比星均 有可能实现。 3.1 柔红霉素的生物合成
CH3CH2COS CoA +
CH2COS CoA CO2H
dps ABCDE
FGHY
12
CO2H O
OH O OH O
12- 脱氧阿克拉菌酸
dnrG CH3
dnrC
O
CO2R
O
CH3 dnrD
OH O OH O
阿克拉菌酸(R=H ) 阿克拉菌酸甲酯(R=CH3)
O
CO2CH3
OH CH3 dnrE
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中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2007, 38(3)
代谢工程研究及其在柔红霉素产生菌中的应用
胡又佳，朱春宝，朱宝泉
(上海医药工业研究院，200040)
摘要：综述了应用代谢工程技术对微生物次级代谢的调控，以及与组学研究相结合的研究进展，并结合我院对抗生素产
HU You-jia, ZHU Chun-bao, ZHU Bao-quan
(Shanghai Institute of Pharmaceutical, Shanghai 200040)
ABSTRACT: The research progress in the regulation of secondary metabolism in microorganism via metabolic engineering and its combination with omics study are reviewed briefly. Especially regarding to antibiotic production, extensive results are described in daunorubicin-producing strain Streptomyces coeruleorubidus.
生菌的代谢工程研究，总结了在柔红霉素产生菌天蓝淡红链霉菌中所取得的一些阶段性研究结果。
关键词：代谢工程；柔红霉素；抗生素；综述
中图分类号：Q789；R979.1+4
文献标识码：A
文章编号：1001-8255(2007)03-0164-06
Metabolic Engineering and Its Application in Daunorubicin-producing Strain
在代谢工程发展的早期，其主要应用包括[2]： ①提高细胞代谢产物的量；②产生细胞本身不能合 成的新物质；③拓展底物识别范围；④改变细胞的 其它生物学特性。随着基因组学(genomics)、蛋白 质组学(proteomics)、转录组学(transcriptomics)、 代谢组学(metabolomics)等相关学科的兴起，众多 专家预测它们将对代谢工程有积极促进作用[3-5]。 代谢工程依托组学(omics)研究的平台，在动植物 代谢工程及疾病诊断和基因治疗等方面开拓了新的 应用领域。
CH3O
O OH O
H3C O OH NH2
多柔比星
图1 柔红霉素和多柔比星的生物合成途径
原、环化和芳香化，得到柔红霉素生物合成途径 中第一个稳定的中间体——阿克拉菌酸(a k l a n o n i c acid)，再形成阿克拉菌酮(aklaviketone)，然后通 过由dnrE基因编码、与NADPH偶联的阿克拉菌 酮还原酶将阿克拉菌酮C-7位还原得到阿克拉酮 (aklavinone)，最后dnrF基因编码的阿克拉酮羟化 酶使阿克拉酮C-11位羟化生成ε-紫红霉酮(ε-rhodom ycinone)[18-20]。
对代谢工程的研究需要对产物的生物合成途径 有较清楚的认识。国外不同实验室分别对产柔红霉 素的波赛链霉菌(S. peucetius ATCC29050)和链霉菌 (S. C5)的生物合成途径进行了研究，结果表明它 们的整个生物合成途径是以1份丙酰辅酶A和9份丙 二酸单酰辅酶A为合成起点，经多次缩合、还原生 成聚酮体链，再经环化、芳香化、甲基化、羟化反 应及其它一些修饰反应，并在从1-磷酸-D-葡萄糖 出发合成的胸腺嘧啶核苷二磷酸-L-柔红糖胺(TDPL-daunosamine)参与下，最终生成产物，如图1所 示。整个过程可分为3个阶段。
代谢工程受到组学研究的深刻影响，目前已完 成约480个物种的全基因组测序，其中超过3/4的内 容已经发表，另有1500多个测序计划正在进行中。 这些已测或待测序列中半数以上是微生物基因组的 测序，植物、哺乳动物等基因组结果的陆续公布也 使传统的代谢工程逐渐向植物、动物及疾病诊断和 基因治疗等领域拓展。比如对植物中生物合成途 径的调控可以大幅度提高二十碳五烯酸 (EPA)和 二十二碳六烯酸 (DHA)等的产量[13]。
的拷贝数、体内增强关键酶的活性、阻断支路代谢 等方面。这在初级代谢产物氨基酸的发酵生产中取 得了很好的效果。色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、丝 氨酸和赖氨酸等的发酵水平已有大幅提高[6, 7]。
代谢工程在对次级代谢产物的调控上也有很大 的应用潜力。聚酮化合物是一类重要的次级代谢产 物，是由简单脂肪酸经类似长链脂肪酸的合成途 径生成的，所得化合物具有复杂多样的结构。催化 聚酮化合物生物合成的酶称为聚酮合酶(polyketide synthase，简称PKS)。通过基因工程方法将编码 PKS基因簇的不同模块进行改造、重组或修饰，甚 至导入异源的PKS基因，可以产生大量新的聚酮类 次级代谢产物。其中以红霉素的生物合成最为典 型。红霉素的生物合成基因共分为6个模块，每个 模块负责1次二碳单位的延伸以完成红霉素前体6脱氧红霉内酯B(6 - d E B)的合成[8]。除了在红霉素 产生菌中进行基因重组外，也有将6-dEB的整套生 物合成基因克隆至大肠杆菌中的报道，生物合成 所需的酶在大肠杆菌中能高表达并正确折叠，对
Key Words: metabolic engineering; daunorubicin; antibiotic; review
代谢工程(metabolic engineering)或途径工程 (pathway engineering)，国外也称为细胞工厂(cell factory)，并归入系统生物学(systems biology)中， 因为其并非单个基因的改变或重组，而是将整个细 胞看成整体，从整体代谢的角度对产物合成进行调 控。1991年Bailey[1]在《Science》上发表的文章标 志着代谢工程作为一门新兴学科走向成熟。
OБайду номын сангаас
CO2CH3
OH CH3 dnrF
O OH CO2CH3
TDP -
OH CH3 L-柔红糖胺
OH O OH O
阿克拉菌酮
OH O OH OH
阿克拉酮
OH O OH OH
ε- 紫红霉酮
O OH CO2CH3 OHCH3 dnrP
OH O OH O H3C O OH NH2
紫红霉素D
O OH CO2H OHCH3
OH O OH O H3C O OH NH2
中间产物
dnrP
O OH
13 OHCH3 dnrK
OH O OH O H3C O OH NH2
13-脱氧洋红霉素
O OH
O
C H
H3
doxA
CH3O
O OH O H3C O
OH NH2
13-脱氧柔红霉素
CH3O
O OH
O OH O H3C O
OH 1
OH
C
中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2007, 38(3)
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6-dEB的合成表现出正常的生物学活性，产量与红 霉素产生菌相近[9]。
在抗生素产生菌的代谢工程研究中，头孢菌素 C(CPC)也是一个重要产品。对CPC的产生菌顶头 孢霉的研究发现，CPC的生物合成中限速步骤有3 个酶[1 0]，分别由生物合成途径中的p c b A B、c e f E F 和cefG基因编码，分属于生物合成的早、中和晚期 步骤。将pcbAB的启动子替换成来自于构巢曲霉的 高效启动子gpd，CPC产量有很大提高；而将cefEF 和cefG基因的额外拷贝导入顶头孢霉，仅单一拷 贝整合入染色体即可检测到更高的转录活性、酶 活力，C P C产量也明显增加 。 [11] 此外，若用带小 棒链霉菌的cefE代替一株顶头孢霉工业生产菌株中 的cefEF基因，重组菌即可高产脱乙酰氧头孢菌素 (DAOC)，产量达CPC发酵产量的80％。而DAOC 可经二步酶法(D-氨基酸氧化酶和戊二酰转移酶)转 化成7-ACA[12]，从而达到高效安全、对环境友好的 生产。 2 与组学研究的结合