第19卷第2期 江西农业大学学报 V o l.19,N o.2 1997年6月 A cta A gricu ltu rae U n iversitatis J iangx ien sis June,1997α小鼠胚胎干细胞培养体系的建立汪河海1 刘红林2 范必勤1 钟 卉3 丁家桐4 (1 江苏农科院牧医所,南京 210014;2 南京农业大学动物科技学院,南京 210059;3 南京铁道医学院,南京 210009;4 扬州大学农学院动物科学系 225009)摘 要通过探讨影响小鼠胎儿成纤维细胞饲养层制备及胚胎干细胞体外培养的若干因素,建立了小鼠胚胎干细胞体外培养体系,并建成小鼠ES细胞系。
关键词:小鼠;胚胎干细胞;培养体系;ES细胞系中图分类号:S865.1胚胎干细胞又称ES细胞(Em b ryon ic Stem Cells)。
其特点是在体外特定的培养条件下能保持其只生长、不分化的增殖状态,并具早期胚胎细胞发育的全能性。
哺乳动物的ES细胞系自Evan s和Kaufm an(1981)首次建立以来[1],引起人们高度的重视,并被广泛地用于动物发育遗传学的基础理论研究和转基因动物的生产实践。
但ES细胞系要在体外克隆成功,必须有成纤维细胞或STO细胞饲养层的支持[2],为建立有效的哺乳动物ES细胞体外培养体系,本文就影响小鼠胎儿成纤维细胞饲养层制备及胚胎干细胞体外培养的若干因素做初步探讨,为今后进一步开展研究奠定基础。
1 材料和方法111 动物准备选3～4月龄的性成熟的昆明鼠,母鼠自然发情或超排后与公鼠交配,第2天早晨检查阴道栓,见栓查为发情受精。
妊娠至一定日龄后取其胚胎或胎儿用于分离囊胚内细胞团细胞或制备胎儿成纤维细胞饲养层。
112 溶液的配制按日本学者管原七郎的配方配制D PB S液,胰蛋白酶溶液、DM E M液及ES细胞培养液(配方略)。
113 胎儿成纤维细胞饲养层的制备α按日本学者管原七郎的方法,取一定日龄的胎儿(10d ～20d ),去除胎盘、胎膜、头、四肢及内脏后清洗并剪碎胎体,将剪碎的胎体组织用胰蛋白酶溶液消化后用100Λm ～200Λm 孔径的尼龙网过滤。
滤液移入离心管中,加DM E M 液稀释混匀后离心(1500r m in ,5m in ),去上清液,再按上述步骤稀释离心2次,沉淀用DM E M 液(含10%FCS )悬浮后吸至6c m 的F lcon dish 中,调整细胞浓度、编号、加盖硅油,于37℃,5%CO 2的气相中培养。
20h ～24h 后换液继续培养,待细胞贴壁长满形成单层细胞后,再用胰蛋白酶溶液消化单离细胞做继代培养。
114 胎儿成纤维细胞饲养层的保存参考陈立人等方法[3],采用继代培养或冷冻保存的办法保存胎儿成纤维细胞饲养层。
其方法是将已长成的单层细胞用胰蛋白酶溶液消化3m in ～5m in ,DM E M 液(10%FCS )中止消化,成片细胞单离后离心洗涤2次(1500r m in ,5m in )后再按上述方法继续培养;或将已消化单离的细胞加入冷冻保护剂(10%DM SD ),调整细胞浓度至5×106～5×107 mL ,移入冷冻管中置液氮上方过夜后浸于液氮中保存。
解冻时将冷冻管自液氮中取出投入37℃温水浴中,待冰晶消失后立即自温水中取出,将内容物移至10mL 离心管中,加入3mL DM E M 液(10%FSC )离心洗涤一次(1500r m in ,5m in ),去上清,沉淀加入3mL DM E M (10%FCS )悬浮、调整细胞浓度至105 mL ,移入培养皿中培养,第2d 更换新鲜培养液继续培养,并观察其活力及生长状况。
115 囊胚内细胞团细胞的分离和培养11511 ES 细胞培养液的制备 将由上述方法制备的小鼠胎儿成纤维细胞换去原培养液后加入丝裂霉素(10Λg mL DM E M )处理培养2h ～3h ,用PB S 洗去丝裂霉素后加入DM E M 液(10%FCS )离心洗涤2次,沉淀加入ES 细胞培养液混匀后做滴培养,24h 后即可贴壁长成单层成纤维细胞饲养层,用于内细胞团细胞的培养。
11512 内细胞团细胞的分离和培养 参考陈立人等方法分离和制备囊胚内细胞[4],并采用3种不同的方法培养囊胚内细胞团细胞,即用经丝裂霉素处理的ES 细胞培养液直接培养完整的囊胚,去透明带囊胚和去透明带及滋养层的囊胚内细胞团,观察比较囊胚的孵出和内细胞团细胞的生长与增殖。
用免疫外科手术法或直接机械剥离法去透明带和滋养层。
前者是收集3.5d 的囊胚,用0.5%链蛋白酶或p ronase E 消化约5m in ,加抗体培养30m in ,再加补体培养30m in ,即可去除透明带和滋养层;后者是直接用玻璃针切开透明带和滋养层,挑出内细胞团细胞。
2 结果与讨论211 妊娠日龄对胎儿成纤维细胞生长的影响试验比较不同胎龄制备的胎儿成纤维细胞生长状况,发现14d ～16d 的胎龄最为合适,其胎儿成纤维细胞贴壁生长能力强,并能增殖形成单层细胞;小于14日龄或大于18日龄的不是不能贴壁生长,就是不能形成单层细胞,分析可能是胎龄与细胞所处的生长发育阶段有关,不同生长时期所需的生长调节因子的种类和数量可能不同[5]。
212 胰蛋白酶作用浓度和作用时间的影响在制备和消化胎儿成纤维细胞饲养层过程中发现胰蛋白酶作用浓度以0.25%,作用时间・85・江西农业大学学报以5m in 最为合适,所得结果最好;作用浓度过高或过低,作用时间过长或过短均不同程度地影响细胞活力及其生长能力,原因可能是酶作用浓度过高、作用时间过长对细胞的结构有一定程度的破坏作用,从而影响其活力;酶作用浓度过低,作用时间不够则不能达到充分消化的目的,细胞不能完全单离,从而影响其生长行为。
213 细胞培养浓度对细胞增殖的影响细胞培养浓度以5×106 mL ～5×107 mL 较为理想;过低则不能很好地贴壁生长;过高则出现一定程度的细胞分化或退化现象。
这提示体外培养细胞时,其生长的行为不仅与培养的条件有关,而且还与细胞间的相互作用有关。
这种相互作用可能是通过细胞与细胞之间的某种物质或信息交流实现的。
214 成纤维细胞的继代培养及冷冻与解冻通过继代培养或冷冻与解冻处理的成纤维细胞还能继续生长、增殖并形成单层细胞,但却出现一定程度的细胞退化或死亡现象,如细胞变形或空泡化等。
这可能反映原代细胞的活力较差,或者说本试验所建立的冷冻解冻条件不合适。
215 囊胚内细胞团的体外培养试验发现内细胞团的制备方法不同,所得培养结果不同。
培养完整的囊胚,48h 后虽能观察到内细胞(I C M )体积增大、滋养层贴壁生长,但未见I C M 由囊胚孵出;去透明带囊胚培养后、I C M 由囊胚孵出,但未形成ES 细胞样集团;直接分离的内细胞团细胞培养后出现明显的细胞增殖,3d ～4d 后可见ES 细胞样集团形成。
试验还比较了免疫外科手术法和直接机械剥离法分离的I C M 的生长状况。
发现前者的效果优于后者,分析可能是免疫外科手术法分离的I C M 细胞较纯,且数量多,机械剥离法分离的I C M 细胞质量少,且混杂有不易去除干净的滋养层细胞,故影响其生长与增殖[6]。
参 考 文 献1 Evans M J ,Kauf m an M H .E stablishm ent in culture of p luri po tential cells from mouse em bryo s .N ature ,1981,(292):154～1562 尚克刚,李子玉,吴鹤龄1建立小鼠多能干细胞系的几个主要影响因素1遗传学报,1992,19(6):491～4963 陈立人,吴明哲,王建平1哺乳动物胚胎干细胞之体外培养( )小鼠与猪胎儿成纤维细胞株之建立1中国畜牧学会会志,1991,20(3):317～3264 陈立人,王建平,吴明哲1哺乳动物胚胎干细胞之体外培养( )小鼠与猪囊胚衍生物之体外培养1中国畜牧学会会志,1991,20(3):327～3395 Stro jek R M ,R eed M A ,Hoover R L ,et al .A m ethod fo r cultivating mo rpho logically undifferentiated em bryonic stem cells from po rcine blastocysts .T heri ogeno logy ,1990,33:901～9056 Papaiannou V E .L ineage analysis of inner cellm ass and trophectoder m using m icro surgically reconsitutedmouse blastocyst .J Em bryo l Exp M o rpho l ,1982,68:199～209・95・汪河海等:小鼠胚胎干细胞培养体系的建立ESTAB L ISH M ENT OF IN V ITRO CUL TURES Y STE M OF E M BRYON I C STE M CELL S IN MOUSEW ang H ehai 1 L iu Honglin 2 Fan B iqin1Zhong H u i 3 D ing J iatong 4(1Inst .of A ni m .H usb and V et .M ed .,J iangsu A cad .of A gric .Sci.,N anjing 210014;2Co ll .of A 2gric .Sci.,N angjing A gric .U niv .210059;3N anjing R ail w ayM ed .Co ll .,N angjing 210009;4D ep t .of A n 2i m Sci.,Co ll .of A gric .Yangzhou U niv .,Yangzhou 225009)AbstractB y w ay of studing the facto rs w h ich influence the p rep arati on of feeder L ayer of em b ry 2on ic fib rob last cells and the in vitro cu ltu re of em b ryon ic stem cells in m ou se ,the in vitro cu ltu re system and the ES -cell lines of m ou se em b ryon ic stem cells w ere estab lished suc 2cessfu lly .Key words :m ou se ;em b ryon ic stem cells ;in vitro cu ltu re system ;em b ryon ic stem cell(ES -cell )lines ・06・江西农业大学学报。