收稿日期： 修回日期： /""" 1 !" 1 !$； /""! 1 "! 1 !W 基金项目： 国家自然科学基金重点项目 （+2$+"/0"） 资助
作者简介： 孟国良 （!2W0 1 ） ， 男， 河南郑州人， 博士生， 副教授， 专业： 遗传学。 =D8： "!" 1 W/$0!#0#； % 1 H:98： HD;<<8X /W+ , ;DJ
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这些问题的方法和对策， 并对一些常规性的操作步骤进行了改进。同时， 对某些尚不明确的问题进行了讨论， 提出 了我们的看法和建议。研究工作表明， 我们采取的对策和方法是可行、 有效的。 关键词： 内细胞团 （ ’()） ； 多方向分化潜能； 正常二倍体核型 %& 细胞； 中图分类号： *#!+ , ! - ! 文献标识码： . 文章编号： （/""!） "/0+ 1 2$$/ "+ 1 "/2/ 1 "+
7),1’-81： E:FDG 6; H:;9I58:J9;< %HKLM6;9? &JDH ?D88F N6L H6LD J@:; JD; MD:LF，OD IL6I6FDG 65L HDJ@6GF J6 F68PD J@D IL6K8DHF 9; DFJ:K89F@9;< :;G H:9;J:9;9;< %& ?D88 89;DF，DFID?9:88M J@D 9HIL6PDHD;J 6N L65J9;D 6IDL:J96;:8 :IIL6:?@ , QD :8F6 G9F?5FFDG F6HD :HK9<565F IL6K8DHF :;G <:PD ?6LLDFI6;G9;< 6I9;96; :;G F5<<DFJ96; O@9?@ O:F IL6PDG J6 KD ND:F9K8D :;G DN7 ND?J9PD 9; 65L 6O; LDFD:L?@ , 9%: ;(’/,： %& ?D88；’;;DL ?D88 H:FF；I85L9I6JD;?M；;6LH:8 G9I869G R:LM6JMID 胚胎干细胞 （ DHKLM6;9? FJDH ?D88F， 是从早期胚 %& 细胞） 胎 （桑椹胚、 囊胚） 或原始生殖细胞 （ IL9H6LG9:8 <DLH ?D88F， 即 分离出来的能在体外永久培养的、 具有多方向分化潜 S4(F）
［(,， ()］ 落典型的特点 。目前， 我们已用 9: ; "# 建立了一个
来源于 ")8?0 + @A 的 $% 细胞系， 并得到了来自该细胞系的嵌
［(@］ 合鼠 。
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传代培养过程中容易出现的问题及解决办法 在 $% 细胞培养中， 常常出现不正常集落， 如： 划格型、 刺
突型、 网络型、 边缘分化型、 铺展型、 弥散型等， 除了弥散型可 以逆转为典型集落外， 其它均为 $% 集落分化的前兆。原因： 饲养层状态差或制作饲养层的胚胎细胞代数太久， 造成细胞 分泌 0!1 的量下降； 传代时间间隔过长； $% 细胞密度过低， 血清更换； 取生长旺盛的 #$ B: 值变化过大等。解决方法： 制作饲养层， 尽可能用 ( ’ & 代的 #$ 细胞， 最好不用满瓶后 进入老化状态的 #$； 控制 $% 细胞接种密度， 以 (4 ) 天 ’ * 天左右传一代为宜； 建系和维持 $% 细胞所用血清应为同一 批次； 注意观察培养液 7: 变化， 及时换液 （最好半换或三分 之二换液） 及传代。 +"# () 细胞系的特异性 例如， 有的 不同的 $% 细胞系所表现的特异性差别很大， 二倍体核型也很难维持； 有的则很不容 $% 细胞系极易分化， 易分化， 二倍体核型容易维持； 大多数 $% 细胞系则介于二者 之间。不同的 $% 细胞系具有不完全相同的特征和营养要 求， 它们对饲养层的质量、 密度， 抑制因子补加量的多少， 血 清的质量以及其它营养状况和环境条件都有不同的需要。 建议： 每个 $% 细胞系都应建立适合其生长的最佳条件， 维持 一个 $% 细胞系的条件不能用于另一个细胞系。 +"’ 血清对 () 细胞的影响 血清对 $% 细胞的贴壁生长、 集落形态有重大影响， 由于 血清更换造成的问题有： 细胞贴壁少， 生长缓慢； 集落弥散型 或网状， 分不清单个集落； 或集落平展暗淡， 没有折光性， 丧 失立体感。解决办法： 一般而言， 每个 $% 细胞系依赖于建系 时所用的血清批次， 若更换血清， 则应以该细胞系为供试细 胞， 在含有待测血清的培养基上进行传代培养 （ 3 ’ (. 代） 和 克隆测试， 测试合格的血清只适用于该细胞系。若用于其它 则仍可能出现以上情况。 $% 细胞系， +"* 染色体变异和基因突变 在建系和维持 $% 细胞过程中， 另一个问题就是具有正 常二倍体核型的 $% 细胞系比例低， 在所建的 )* 个细胞系 中， 只有 )./ 的细胞系具有正常的二倍体核型 （ 2 3./ ） ， 具 有正常核型的 $% 细胞系在传代培养过程中也会发生核型改
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孟国良等： 小鼠胚胎于细胞 （ $% 细胞） 建系和维持过程中的问题及对策
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结构的细胞团， 此时不必立即分胚， 因为 这时的 !"# 对酶相 当敏感， 离散 !"# 后出现 $% 集落的可能性小， 应继续观察 在 !"# 增殖到足够大、 又没有分化迹象时 !"# 的增殖情况， 再分胚， 分胚后出现新 $% 集落的可能性增大。 !"# 离散增殖的 $%& 这一步有两个关键点， 即 !"# 的转移方法和消化时间。 当 !"# 增殖到可以离散的程度时， 先用钝头毛细管将其挖 出。用毛细管吸取时， 最容易丢失大而生长快的增殖 !"# ， 因其外围粘性较大， 附着力强， 易附着管壁； 解决办法： 加大 毛细管末端口径， 通过虹吸先自然吸入少量培养液， 再以适 宜的力度吸取 !"# ， 这样做， 不容易丢失 !"# 。由于 !"# 个 体差异很大， 很难确定消化时间， 不同的人在建系时所用的 消化时间差异很大 （ & ’ () 分钟） 。如果消化一定时间后 再吹打 !"# ， 容易消化过度， 造成细胞大部分或全部死亡。 解决办法： 将 !"# 放入稀释一倍的酶液中， 即开始用约 ( + , 直到 !"# 裂解为几个大小不 !"# 直径的毛细管轻缓吹打， 一的细胞团块时， 迅速加入终止液或直接转入 , 孔板中。注 意： 此步骤若将 !"# 消化吹打分散为单个细胞， 接种后很难 出现新的 $% 集落； 在轻缓吹打过程中， 最容易丢失细胞， 可 用装上 ) 效果很好。 - 吸头的微量加样器替代， ! !"’ () 集落的离散 离散的 !"# 重新接种后， 可以出现各种细胞集落， 主要 包括 , 种类型的细胞： 滋胚层细胞集落， 内皮样细胞集落， 上 皮样细胞集落和 $% 样细胞集落。挑选生长良好、 没有分化 离散 $% 集落时， 迹象的 $% 集落进行扩增。用口叼管吸取、 往往容易丢失大而形态好的 $% 集落。为了避免集落丢失， 这一步完全可以用装上 ) 获得率 - 吸头的微量加样器替代， ! 这一步将 $% 集落消化为若干细胞个细 可达 (../ 。注意： 胞团即可， 不要分散为单个细胞， 原因同上。 !"* 建系过程中的分化问题 有些 $% 集落离散后重新接种容易分化， 分化与未分化 集落并存。原因： 对分化抑制剂的量要求较高。以前出现这 种情况时， 总是将这种培养物弃之不要， 实为可惜。解决办 法是： 加大饲养层密度和 0!1 含量， 进行亚克隆， 可以得到生 长快、 集落形态良好的 $% 细胞系。
+
() 细胞的维持
主要是在传代培养过程中维持 $% 细胞的未分化多能状
态和正常二倍体核型 （ 2 3./ ） 。 +4! 培养条件 我们曾采用 %56 细胞系和不同代次的小鼠胚胎细胞制 备饲养层 （ 7#$1） 培养 $% 细胞， 结果表明： 用 %56 饲养层培 养 $% 细胞时， 可以较好地维持 $% 细胞的未分化状态， 但是 集落形态不够典型， 且不能有效维持其二倍体核型； 用(’& 代的 7#$1 培养 $% 细胞时， 可以理想地维持其未分化状态，
［T U #］ 索以及细胞、 组织和器官的修复与移植等领域 。由于在
［2 U !!］ ， 根据我们的经验， 建系率偏低有以下几种原 !"V 左右
因造成， 对此， 我们也提出了具体的解决办法。 <,< 胚胎收集 经常出现的问题是在显微镜下用玻璃毛细管吸胚时， 由 于不易掌握吸气的力度， 造成液流上窜， 冲胚液和毛细管壁 的张力附着容易造成胚胎丢失。解决办法是： 增加毛细管细 端直径至 /"" 找准胚胎在培养皿中的位置， 仅靠溶液 8 左右， ! 的虹吸现象即可将胚胎吸出， 得胚率达 !""V 。 <=> 选择离散 ?53 的时机 这是影响建系率的关键因素之一。一般认为小鼠胚胎 接种到培养孔 T U W 天时， 离散 ’() 比较合适。我们认为， 应该按以下的方法确定适宜的离散 ’() 的时机： 接种 T 天左 右 大多数贴壁胚的 ’() 增殖形成一紧密排列的、 呈圆柱状