为了避免批次差异对实验的影响，要根据实验计划
一次买足，避免中途更换，同时每个批次的血清要
用克隆形成效率检验。
部分血清在低浓度时效果很好，但高浓度
（如40%）时出现毒性，选择时要选择那些 高、低浓度效果均佳的血清。
由于专业技能和使用试剂批次的差异（特别
是胎牛血清），ES细胞的建系在不同实验室 变化很大。因此需要开发定义明确的培养条 件，如使用化学成分确定的血清替代物。
排卵雌鼠的胚胎数目较大。
这两种条件下，通常从3.5dpc动物子宫收集
胚胎，此时胚胎正好处于囊胚期，不需要进 一步培养即可用于建立ES细胞。
细胞核移植获得胚泡

利用显微操作方法把供体细胞核移植入去核 的受体卵母细胞中，然后经过活化后获得重 构胚胎的过程。
重构胚胎在体外发育到囊胚阶段后，一方面 可以移入受体动物体内以获得克隆动物，另 一方面，可以用于建立核移植胚胎干细胞系 (ntES)。而ntES 细胞可以在体外被诱导形成 特定的体细胞用于治疗。
显微外科法

小鼠受精后3-4天，利用显微操作系统直接从胚泡 中吸出内细胞团细胞进行培养。该方法需要专门 的仪器设备，技术要求较高，难以推广。
组织培养法

模拟体内胚泡的着床过程：在获取时，胚胎被透明 带(zona pellucida,ZP) 包围。体外培养时，ZP的变 薄、破裂将诱导囊胚向灭活的细胞饲养层贴附。 囊胚逐渐脱离ZP，开始向饲养层贴附，注意不要轻 易晃动培养板，至少保证孵育箱门关闭48小时，接 种2-3天后观察并更换培养基。 囊胚贴附后，细胞将很快贴着饲养层表面长出，随 后几天要注意观察，确定首次分散的最佳时机。
序一致。
karyogram of a mouse ES cell with 2n= 40. Color karyotyping demonstrates a trisomy for chromosome 8 and the absence of the Y chromosome

目前建立的大多数小鼠ESCs系都是XY型， XY型小鼠ESCs比XX型的核型容易维持。 XX型ESCs系在传代过程中常发生一条X染 色体缺失，不容易维持其二倍体核型，2条 X染色体存活似乎对细胞增殖不利。 ESCs保持核型完整与多种因素有关，如饲 养层细胞类型、细胞传代程序、培养液构 成及其稳定、细胞性别以及小鼠品系等。
1.7 病原体的排除

从活体动物衍化ES细胞，总是伴随着将动
物病原体传播到组织培养物的风险。因此， 要分别使用各自的培养基、试剂、超净台和
孵育箱，直至建立的细胞系经过筛查而确保
没有病原体。
二、影响小鼠ES细胞建系效 率的因素
2.1遗传背景
最容易衍生的小鼠品系是内交129亚系，但该
亚系存在特征描述不充分、解剖和行为异常的 缺点。


A 将高质量的囊胚接种在MEF上，准备进行ES细胞 的衍化；B 处于孵化后期的胚胎；C 贴附的胚胎； D 生长变大
E 可以见到ES样细胞区域; F 区域变大，适合 分散
首次分散的时间是成功建立ES细胞系最
关键的因素：分散太早，没有足够的细
胞量；太晚，细胞开始分化，形成特异 性的细胞类型而不再是ES样的克隆。
三、小鼠ES细胞系的特征描述
3.1 细胞形态

小鼠 ESCs大小处于7~18μm之间，胞核大，胞核内有多个 核仁，胞浆少，核质比高，与胚胎细胞相似。

体外培养时，ESCs呈集落状生长，形成隆起、致密、折光
性强和边界清晰的细胞集落，集落形态多呈岛状或鸟巢状，
呈圆性、椭圆性、纺锤性或梭形等，集落内细胞排列致密，
传代时要小心、反复吹打，使细胞分散成单细胞悬
液。如果接种的是小细胞团的话，就会引发ES细
胞分化。
1.6 ES细胞系的冻存
ES细胞系的质量的关键是确保其较低代数。早期
代数的细胞以后可以扩增出一个细胞系；在此过
程中，应该连续冻存每一代细胞。
最宝贵的早期代数瓶是很容易丢失的，因此除了
将这些“宝贝”用于开始的特征描述和扩增，不 要浪费在其他用途上。
胞培养的标准操作规程传代。通常把首次接种到
较大面积的细胞记为第一代。
1.5 ES细胞的传代培养
不要等到细胞铺满使培养基极度酸化时再传代；要
避免继续分裂的细胞死于极度拥挤和营养耗竭。
传代可望收获3×105个细胞/cm2，再以2×104个
/cm2的密度接种。规律更换培养基，大约3天左右
传一次代。


固定，Giemsa染色。通过形态和染色鉴定 ES细胞克隆。分化细胞的克隆着色浅淡。 计数克隆总数和ES细胞克隆占克隆总数的 比例。
2.3 提高效率的改良技术
初次接种时，将培养基中的FBS增加至
25%。 选用低糖DMEM，并在培养基中添加核 苷。 分离延迟发育的胚胎，即经卵巢切除和 使用孕酮而不能植入的胚胎 接种前使用免疫溶解法去掉囊胚外面的 滋养层细胞。
分散过程要注意使用温和的手段，将外
生物分散成含有5-10个的小细胞团。
1.4 首个ES细胞样克隆的扩增
经过首次分散后，通常生长缓慢，需要耐
心等待小克隆的出现，一旦确定细胞生长， 就要再次每天观察培养物。 可能三种生长情况：
非ES样/细胞类型的克隆生长；
主要为ES样克隆的生长；
ES样克隆和混合细胞类型克隆的生长。
第四课
小鼠胚胎干细胞 的培养和分化
内容提要
1.
2. 3.
小鼠ES细胞建系过程和关键所在
影响小鼠ES细胞建系效率的因素 小鼠ES细胞的特征描述
1.1 胚泡来源
延迟着床方法获得的延迟胚泡
自然状态下合笼获得的正常胚泡 超排卵法得到超排卵胚泡
通过核移植的途径获得重构胚,
进而获得胚
泡。
延迟植入囊胚步骤

DEVELOPMENTAL DYNAMICS 235:2460 –2469, 2006
1.2 饲养层准备

饲养层能够抑制ES 细胞的分化, 一般认为是 由于饲养层可以分泌白血病抑制因子( LIF) 以及成纤维细胞生长因子(FGF), 前者是释放 到培养基中, 后者结合在饲养层的细胞膜上。 有两种细胞可以充当饲养层细胞：STO细胞 和小鼠原代成纤维MEF细胞。
要求：新鲜配制、理想密度、代数较低。


STO成纤维细胞

STO细胞是来自SIM小鼠的成纤维细胞，广 泛用于多潜能畸胎瘤细胞及胚胎干细胞的培 养。
STO作为连续细胞系具有明显优点：连续传 代，易生长；但应特别注意保持STO细胞生 长的最佳条件，密度不能太高，传代20-30 次后，应重新复苏。

STO饲养层的制备
病原体检查不但有利于将来使用这些ES细 胞生成不含特殊病原体SPF动物，而且还有 利于避免将病原体传染给其他细胞培养物。 最常见的病原体是支原体。


3.3 核型分析

核型是指染色体组在有丝分裂中期的表型，包括染色
体数目、大小、形态特征等。

核型分析是指在对染色体进行测量计算的基础上，进
行分组、排队、配对并进行形态分析的过程。核型分

AP staining of mouse ES Cells
端粒与端粒酶

端粒是位于染色体末端的特殊DNA-蛋白质结 构, 由一段TTAGGG重复DNA序列及相关蛋 白质组成。其长度作为评估细胞分裂及细胞 衰老的生物时钟，它在每一次细胞分裂中都 会缩短50~100bp，但可以被端粒酶修复。

STO细胞在10cm培养皿中铺满后，用 DMEM/10%NCS+10μg/ml丝裂霉素C孵育 2-3小时。

PBS洗涤——胰酶消化——洗涤——培养 基重悬——接种明胶包被的培养皿备用 （不超过一周）。
STO feeder cell
MEF饲养层的制备
MEF取自交配日后12.5d的ICR孕鼠，3-6代
有人提出使用交替使用胎牛血清和血清替代
物的解决方案，可以达到75%的成功率（一 般是25%）。
集落形成试验检测培养条件
在6孔板中加入待测培养基（2ml/孔），添 加物为终浓度的两倍；如果检测血清，则 需要设置5%、10%和20%三种浓度。 ES细胞半铺满时，通过胰酶消化，最终用 无血清培养基分散ES细胞成单细胞悬液， 以103个/ml的密度重悬于生长培养基。 每孔加入2ml细胞悬液，使添加物在4ml终 体积中为1×，正常培养6-8天。

雌、雄合笼过夜，次晨检查雌鼠阴道栓，有 栓雌鼠分开饲养（记为0天）。
Hale Waihona Puke 第二天通过腹腔注射10μg它莫西芬和1mg Depo-Provera，来降低雌激素水平而保持孕 激素水平。
在第6-8天处死动物，冲洗宫腔获得延迟植入 囊胚，其个体较大，外观略粗糙，常有清晰 可见的ICM。


使用延迟植入囊胚并不影响胚胎的贴壁, 主 要是在ICM 的增殖方面明显地优于正常的胚 泡, 因此也对后来的ES 细胞集落的出现和生 长带来有利的影响。
析用于确定细胞系的性别以及检测可能存在的染色体
畸形。一个成系的ESCs系应该具有70%以上核型完整
的细胞。
核型分析方法

标准G带法：将中期染色体制片经过胰酶或热、碱 、尿素、去垢剂处理后再用 Giemsa染料染色后呈
现的染色体区带。一般至少需要分析20-30个中期
铺片。

ESCs核型分析方法与体细胞没有区别，总体上程
如果6天以后还未可见的细胞生长或只有非
ES样的克隆，即可放弃培养
A 混有多种细胞类型的克隆；B 已经分化了的非ES样细胞 C 典型ES样克隆； D 仅含ES细胞的小克隆

对于既有ES样克隆又有混合细胞类型的克隆的情 况，在轻柔分散后挑取单个的小克隆，转移到备 有新鲜培养基的新孔中培养。