C 反义RNA模型； D RNA介导的病毒抗性模型；
（4）从头甲基化与沉默机制 A 植物对外源DNA的基因免疫诱导反应； B DNA-DNA配对诱导； C DNA-DNA互作诱导。
4. 克服转基因沉默的策略
(1) 转基因的选择： （2）启动子的选择； （3）利用组织和发育特异性作用的增强子 （4）利用MAR序列； （5）利用位置特异性重组系统； （6）选择单拷贝的转化体。
E 交叉相连的DNA链经旋转形成Holliday中间体； F Holliday中间体分枝迁移数个碱基后，另一条链再断裂并与对方的 断裂链重组，这时就完成重组，实现了交换。
（3）位点特异性重组在转基因整合遗传特性研究中的应用
A 控制转基因整合的拷贝数；
B 可导入多个基因进入植物基因组； C 使目标基因重排；
在44个转KM抗性基因的烟草中，通过转基因植株自交、转化与非转化杂 交、转化株杂交进行分析，发现35个无性系包含一个单位点插入KM抗性基 因，其余5个为两位点插入，且观察到双位点插入导致自交后代中出现隐形 致死突变。 多基因转化植株后代分离规律与其整合特性密切相关，多基因连锁形式整 合到一个位点，其符合单基因的孟德尔式分离规律；如分别整合到不同位点， 那么每个基因的分离符合孟德尔式规律，各个基因间不影响。
（2）转录水平的基因沉默 A 转基因及其启动子甲基化； B多拷贝重复基因序列引起的转录水平基因沉默； C 同源基因间的反式失活； D 转基因位置效应引起的转基因沉默； E 染色体包装对转基因沉默的影响； F 后成修饰作用导致转基因沉默。
（3）转录后水平的转基因沉默
A 生化开关模型；
B 异常RNA模型；
当两个loxP基因座方向相同，Cre介导的反应造成loxP基因座之间的 DNA被删除，loxP基因座方向相反，Cre介导使两端携带loxP的片段发 生倒位，如果loxP 不在同一DNA分子，如一个在质粒上，另一个在染 色体上，那么Cre酶可使质粒DNA整合到染色体loxP所在位置，实现定 点重组。
四类定位重组系统的分子重组程序分以下几步：
5、位点特异重组
（1）位点特异性重组系统
遗传重组分为3类：同源重组，转座和位点特异性重组，也称定位 重组。同源重组发生在两个具有一定程度同源性的DNA分子之间或同 一分子的两个同源性区域，它们相互重组。转座和位点特异重组的共 同点是重组只发生于具有特定的DNA序列的位置上，由特定的酶来识 别某一种DNA序列，而造成重排。二者的区别在于转座重组中，识别 位点之间的DNA片段被转位插入到另外的位点，是DNA合成过程中 伴随而发生的DNA断裂、转移和插入。而定位重组并不涉及DNA的 净合成，在两个识别位点之间的DNA片段并不转移到基因组中的另一 地方，这段DNA是在重组酶所识别的位点上进行重组、交换而被切除 或发生倒置，该定位系统越来越多地应用于转基因植物中，以改造基 因重排，去除不需要的筛选基因、激活或缺失某一表达基因。
4、转化方法对整合外源基因结构的影响
尽管转化方法较多，但外源DNA以两种分子形式转化，一种是外源 DNA插入T-DNA质粒载体中导入；另一种是裸露的DNA分子直接导入， 由于转化原理不同，因此与整合后的外源DNA结构必然存在直接关系。 （1）T-DNA转化的外源DNA结构变化 农杆菌介导转化细胞中T-DNA结构完整，整合位点稳定，多数情况 下在25bp处与植物DNA连接，整合后的外源基因结构变异少，但外源 DNA也会出现结构变化，表现为T-DNA的串联和截短现象。 T-DNA串联：通常有5-20个拷贝的T-DNA的首尾相联，在大多数整合 事件中，T-DNA可以在无选择压的情况下串联起来。 T-DNA截短：也是T-DNA转化时较多发生的结构变化，可能是由于TDNA两侧各有一个25bp的边界类似序列。截短是在转移和整合过程中 产生，由于T-DNA区内‘框类似’序列的存在，被用作引导T-DNA转 移和整合的次级识别位点，从而代替正常情况下的25bp右边界序列， 所以正常的有边界序列被截短。 截短在共整合载体中比二元载体系统更易发生。
A.单位点插入外源基因： 大多数转化植株中，转基因呈单基因显性的孟德尔式分离。转基因有可 能作为一个单个显性基因在转基因植株中遗传，相对于转基因来说，植物同 源染色体中没有其相对的等位基因位点，因此转基因一般呈显性遗传。 单位点插入无论是单拷贝还是多拷贝串联，在不超过一定长度时，大多数 转基因植株中外源基因能够稳定遗传并显示孟德尔单基因分离规律。
外源基因在转基因植物中表达受到抑制的现象称为转基因沉默，转基 因沉默是遗传工程走向应用的潜在障碍，成为基因工程中的重要问题。 （1）转基因沉默的机理概述 20世纪80年代后期，基因沉默主要涉及到转基因与转基因之间或转基 因与内源基因之间的互作，认为沉默的来源于多拷贝的同源DNA序列， 这些序列指蛋白质编码区，启动子或两者皆有。已提出三种基因沉默模 型： 顺式失活；即多拷贝，串联基因的导入常常导致倒位或直接重复引起失 活； 反式失活；可以看作顺式失活的副产品，指因顺式作用失活的转基因可 以作为一种沉默子，使独立DNA分子上的同源靶基因引起相似水平的甲 基化和失活； 共抑制或有义抑制，涉及到一个转基因与一个同源的内源基因或两个同 源的转基因之间的协同沉默。三种模型均涉及核酸互作而引起的变化， 如DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA等。 转基因沉默主要发生在两个阶段，一是发生在转录水平；二是发生在 转录后水平上。
B. 多位点插入外源基因： Akama 等（1992）在拟南芥中发现R1代植株中有10株抗性分离比为 3R:1S，3株为15R：1S，1个株系为63R：1S。表明多数情况下外源基因为 单位点插入，但也存在二、三个位点插入。进一步对124个转化株进行分子 杂交，分析T-DNA的拷贝数，拷贝数为1、2、3个T-DNA者分别为44%、 28%和10%，即90%插入拷贝数在4个一下，也有10个拷贝的个体。
2、外源DNA结构对整合的影响
外源DNA结构分为四种类型：单链线形DNA、单链环形DNA、 双链线性DNA及双链环形DNA。四种结构中单链线状DNA研究较 多，一般认为单链DNA可以通过有效的不正常整合参与同源染色 体序列的重组，研究认为单链DNA在单链完全变成双链之前已发 生重组。此外Bilang等（1992）研究了导入烟草的DNA结构（线 形和环形）的重组效率，结果表明线性单链DNA同环形单链DNA 相比，其抗性愈伤组织数目要高于后者，说明线性DNA的整合效 率要高于环形DNA。
（2）裸露DNA直接转化的外源DNA结构变化 采用裸露DNA直接转化时，整合的外源DNA往往出现复杂的杂交 图谱，在转化当代及子代中常出现DNA环化、甲基化、片段分离和丢 失等现象。 在DNA直接转化中供体DNA容易在整合过程中发生各种结构变化和 修饰，而且植物靶DNA序列也可在供体DNA整合过程中发生重排。
（2）非孟德尔遗传现象： 转基因植株后代分离中，普遍存在显性个体明显不符合孟德尔比例的现象，成 为非孟德尔遗传现象。后代显性个体比例明显低于3：1，此外在自交二代中， 由于转基因的失活、纯合致死等未知原因而未出现纯合体。 A. 转基因丢失：如小麦转化株系中，自交一代能表达，自交二代仅能检测到，自 交三代中发生了丢失。 B. 转基因沉默：转化体仍保留完好的转基因但不表达或表达活性低，或发生重排 而不表达，导致后代分离规律的异常。 C. 转基因逃逸：采用酶活性检测得到的3：1的分离中，部分转化体中仅有20%含 目标基因片段，因此需采用标记选择、表达分析及分子检测相结合的方法检测 转话体。
2、重组效应：
转基因容易被植物基因组存在的重组和修复系统识别，致使转基因 不同程度的重排，转基因同源和非同源重组必然引起DNA的易位， 缺失、重复等一系列结构变化。 外源基因结构变化甚至不同位点碱基序列的变化对其表达的影响 不同，表现为DNA重组的多样性：正效应、负效应及无影响等状态。
3、转基因沉默
三、转基因植物中外源基因的遗传特性
通过转基因技术导入受体细胞的外源基因（transgene）进入受 体细胞后，其整合、表达和传递规律通常利用表性传递、标记基因及 分子杂交分析等方法进行研究。
1.外源基因在转化植物中的遗传传递规律
（1）孟德尔式分离: 1984年David报道，发根农杆菌介导的胡萝卜、烟草和牵牛花转基 因植株表型分析和Southern杂交证明，后代中显性位点的遗传为真 实的孟德尔式遗传。
转基因植物的遗特性与表达调控
一、转基因植物中外源DNA的整合特性
1、外源DNA的整合位点和拷贝数
（1）整合位点：转基因导入植物细胞后，通过细胞分裂时遗传物质的复 制过程整合到核基因组中，目前普遍认为，转基因在寄主染色体内的整合 位点是随机的, 外源DNA可以插入植物基因组的任何一条染色体，也可以 插入一条染色体的任何位点或没有固定的插入位点，但往往对转录活跃区 域具有优先插入特性。 （2）整合拷贝数：许多研究表明，外源DNA的插入拷贝数有以下几种：单 拷贝单位点插入；串联多拷贝单位点插入；多拷贝多位点插入，多数情况 是以单拷贝在单位点整合，但在同一位点，也存在较多的多个拷贝串联整 合的情况。形式为头对尾式串联和头对头式串联。农杆菌转化和基因直接 转化整合拷贝数存在差异，前者拷贝数少，整合位点特异性强。
3、转化后整合位点的DNA结构变化
保持整合外源基因的完整性是实现转基因功能表达的基本条件，外源 基因整合后的完整性与其结构变化有关，现已明确，外源基因作为侵入 者的整合，会引起不同程度的基因重排，涉及缺失、异位、倒位及重复 等一系列现象。这主要与细胞本身的重复和修复功能有关。 Mayerhofer等（1991）和Gheysen等（1991）对15个独立的T-DNA插 入进行了研究，提出了外源DNA整合模型， 他们认为： （1）T-DNA的插入不会引起植物DNA大的重排，但在T-DNA的两侧各出 现了一个158bp的正向重复序列，且多数插入会导致靶位点处小的缺失， 最多79个核苷酸； （2）在T-DNA和植物DNA连接处常有几个至33个核苷酸的填充DNA， 这些填充序列与靠近连接处的植物DNA序列相似； （3）在靶位点处不要求有特异的序列，但若T-DNA两端与植物靶位点之 间有一段短序列（5-10bp）同源，则可能对T-DNA整合进植物基因组其 作用。 此外，插入植物染色体的外源DNA大小是有限制的，如油菜插入外源 DNA为5-6Kb，烟草中最大可达9Kb，但频率较低。