5)直接按到第二档吸液(应该按照上述标准方法操作)。
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2. 分光光度计使用及注意事项
1. 接通电源，预热。 2. 按要求输入各项参数，选择相应比色杯（玻璃或石英），将空白管、
标准管及待测管依次放入比色皿架内，关上比色池盖。 3. 以空白管调零。 4. 试样槽依次移至样品位置，直到所有样品检测完毕 5. 检测结束后应及时取出比色杯，清洗干净放回原处，同时关上仪器
注：标准曲线不能任意延长！
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理想标准曲线的特点
过原点的直线; 斜率为1； 浓度为待测物质浓度的
0.5～2倍； A值在0.1～ 0.7之间
C（mg/ml）
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偏离Lambert – Beer定律的原因
正偏离
负 负偏离 偏 离
流就越多，样品离子介导的电流越少，则带电颗粒的 泳动速度越慢；反之则反。低离子强度的缓冲液降低 了总电流，减少了产热；但其缓冲能力低下，会导致 样品扩散，降低电泳的分辨率。一般选择离子强度范 围在0.02~0.2之间。
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1. 微量移液器的使用
三、常见的错误操作
1)吸液时，移液器本身倾斜，导致移液不准确(应该垂直吸液，慢吸慢放)。
2)装配吸头时，用力过猛，导致吸头难以脱卸(无需用力过猛，选择与移液 器匹配的吸头)。
3)平放带有残余液体吸头的移液器(应将移液器挂在移液器架上)。
4)用大量程的移液器移取小体积样品(应该选择合适量程范围的移液器)。
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吸收光谱曲线特征
物质对光的吸收是选择性吸收；不同物质对光的吸 收范围、强弱不同；
吸收的波形与物质性质有关，与浓度无关； A值最大时的波长称λmax；在λmax时测量A灵敏度
最高。
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吸光系数k
k的物理意义是： 吸光物质在单位浓度及单位
2. 由于不同介质支持物的电阻值不同，电泳时所通过的电流量也不 同，其泳动速度及泳至终点所需时间也不同，故不同介质支持物 的电泳不要同时在同一电泳仪上进行。
3. 使用过程中发现异常现象，如较大噪音、放电或异常气味，须立 即切断电源，进行检修，以免发生意外事故。
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实验内容 ·两条主线
参考值 血清或血浆： 3.89-5.83 mmol/L (70-105 mg/dL)
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血清胆固醇浓度= A测定管 × 标准胆固醇浓度
A标准管
血清胆固醇浓度范围：2.33-5.17mmol/L (90-200 mg/dL) 临界高胆固醇血浓度：5.20-6.10mmol/L (210-239 mg/dL) 高胆固醇血浓度： ≥ 6.2mmol/L (240 mg/dL)
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依据Beer定律，A与C关系应为经过原点的直线
偏离Beer定律的主要因素表现为以下两个方面：
1. 光学因素
因仪器产生的入射光单色性不纯、杂散光、单色器的 内反射，电压不稳、仪器的灵敏度的波动等各种因素。
2. 化学因素
(1) 溶液的稳定性（浓度、pH值、溶剂和温度等导致 溶液组成发生变化）；
电泳及其分离原理 影响电泳速度的因素 常用的电泳支持介质 电泳后的染色 电泳的应用
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1. 电泳及其分离原理
电泳：是指带电颗粒在电场中向本身所带电荷相反 的电极移动的现象。
电泳技术：利用在电场的作用下，由于待分离样品 中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性 质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而 对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。（利用电泳 现象）
1. 微量移液器 2. 分光光度计 3. 离心机 4. 电泳仪
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1. 微量移液器的使用
一、标准操作 适用的液体：水、缓冲液、稀释的盐溶液和酸碱溶液。 1)设定体积：请勿将体积调整圈转到超过最低/最高的使用范围。 2)按到第一档，垂直进入液面几毫米。 3)缓慢松开控制按钮，避免液体快速通过吸头人移液器内部。 4)打出液体时贴壁并有一定角度，先按到第一档，稍微停顿1s 后，待剩余液体聚集后，再按到第二档将剩余液体全部压出。
厚度时的吸光度。在给定条件（单色光波长、溶
剂、温度等）下，k是物质的特征性常数
当c的单位用g·L-1表示时，用a表示，
A＝abc
a 的单位: L·g-1·cm-1
当c的单位用mol·L-1表示时，用或EM表示. －摩尔吸光系 数
A＝ bc
的单位: L·mol-1·cm-1
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单链核酸的浓度 C＝A260/ε= A260 ×40 （µg/ml）
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吸光光度法的应用
蛋白质含量的测定 核酸含量及纯度的测定
DNA A260/A280=1.8 A260/A280>1.9，有RNA杂质，用RNase消化； A260/A280<1.7,有杂蛋白，重复抽提纯化步骤; A260/A230<2.0，可能有盐未除尽。 ALT活性的测定 血糖及血清胆固醇的测定
C＝A /ε 例如：已知蛋白质溶液在280nm波长处的ε值， 读取待测蛋白质溶液的A280值，即可计算出待测蛋 白质溶液的浓度。详见教材P62~63。
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例如：双链核酸的ε值为0.02，单链核酸的ε值为 0.025。因此
双链核酸的浓度 C＝A260/ε= A260 ×50 （µg/ml）
Welcome to Biochemistry Laboratory
生物化学实验总结
武汉大学 生物化学与分子生物学系
实验内容
一、常用仪器的用途与操作 二、物质含量（浓度）的测定 三、生物大分子的分离、纯化与鉴定 四、酶学研究（酶活性测定、酶法分析）
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一、常用仪器的用途与使用
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Folin—酚试剂法(Lowry法)
原理：蛋白质中含有酚基的酪氨酸，可使酚试 剂中的磷钨酸—磷钼酸还原而呈蓝色
显色反应，蓝色。A650 在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。
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血液葡萄糖浓度=
A测定管 × 标准葡萄糖浓度 A标准管
(2)溶液介质不均一引起（悬浊液、乳浊液等） (3)溶液的浓度（过大时，吸光微粒的电荷分布互相
影响，改变其吸光能力） 因此Lambert-Beer定律一般适用于稀溶液的测定。
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Lambert-Beer定律的应用
2. 标准管对照法
先配制一个与待测溶液浓度相近的标准溶液(其浓度
生化技术的应用 生物大分子的研究
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二、物质含量（或浓度）的测定
1 吸光光度法
基于物质对不同波长的光具有选择性吸收而建立 起来的分析方法。包括比色法、可见光及紫外分光 光度法、红外光谱法等。
可见光：人眼能感觉到的光（380~780 nm）叫可见光。白光是 由红橙黄绿青蓝紫七种不同颜色的光按一定强度比例混合而成， 称为复合光，只有一种颜色的光即单一波长的光称为单色光。
度大，浓度高时也不会引起蛋白质活性丧失。蛋白质用盐析法沉淀分离后，
还需要脱盐才能进一步精提纯。脱盐常选用透析Dialysis或凝胶过滤。
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三、生物大分子的分离、纯化与鉴定 细分级分离
1. 电泳法 2. 层析法 3. 排除法
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(一). 电泳法（Electrophoresis）
已知，用c标表示)，在λmax处测出其吸光度A标，在 相同条件下测出待测样品溶液的吸光度A测，则待测 样品溶液浓度c测可按下式求得：
c测＝ (A测/ A标) × c标
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Lambert-Beer定律的应用
3.利用消光系数求待测样品浓度 如果已知待测物质的摩尔消光系数ε，则其浓度
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泳动度或迁移率( mobility, m)
d为带电颗粒泳动的距离(cm) L为支持物的有效长度(cm) t为通电时间(s) v为加在支持物两端的实际电压(V)
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2. 影响电泳速度的因素
待分离生物大分子的性质 分子形状Shape 分子量大小Size 所带净电荷量Net charge (pI-pH)
1. 首先将电泳槽的两个电极与电泳仪的直流输出端用导线连接，注 意极性不要接反。
2. 接通电源，缓缓旋转电压调节钮直到达到的所需电压为止，设定 电泳终止时间，此时电泳即开始进行。
3. 工作完毕后，应将各旋钮、开关旋至零位或关闭状态，并拨出电 泳插头。
注意事项
1. 电泳仪通电进入工作状态后，禁止人体接触，如需要应先断电， 以免触电。
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光吸收基本定律:Lambert-Beer定律
A=kbc
A — 吸光度(absorbance) b — 溶液厚ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ(length/cm) c — 浓度(concentration)
k — 吸光系数(absorptivity)与物质性质、温度、
波长有关；
Lambert-Beer定律的物理学意义：当一束平行的单色光 通过均匀透明的溶液时，该溶液对光的吸收程度与溶液 中物质的浓度和光通过的液层厚度的乘积成正比。