一．核酸简介 二．基因组DNA提取 三．质粒DNA提取
四．真核细胞总RNA提取
五．琼脂糖凝胶电泳

总RNA提取——通用方法
2011年7月
异硫氰酸胍/苯酚法（TRIzol法）
原理： 核酸在中性条件下，因磷酸基解离而带负电荷，这一
部分由于水化而溶于水。而在酸性条件下，磷酸基的负电

2011年7月
一．核酸简介
二．基因组DNA提取 三．质粒DNA提取 四．真核细胞总RNA提取

基因组DNA提取方法
2011年7月
基因组DNA提取的几种常用方法： CTAB法
SDS法 其他方法

2011年7月

质粒DNA提取——实验流程
2011年7月
对数期菌体
上清液
溶液I充分重悬
过柱
质粒DNA溶液
溶液II裂解
离 心
离心洗涤
溶液III中和
干燥溶解

详细实验步骤请参考说明书！
质粒DNA提取——电泳检测
2011年7月
3% (W/V)
5% (W/V)
PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形
成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中
酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。

基因组DNA提取——CTAB法
2011年7月
CTAB法实验流程
植物材料
抽提
离心洗涤

基因组DNA提取——CTAB法
2011年7月

CTAB提取缓冲液的经典配方
组份 终浓度 Tris-HCl （pH 8.0） 100 mM EDTA （pH 8.0） 20 mM NaCl 0.4 M CTAB 2% (W/V) β-巯基乙醇 0.1%（V/V） 使用前加入
核酸简介
2011年7月
如何分离DNA？
如何分离RNA？

核酸简介——质粒DNA
2011年7月
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大小 从1-200 kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋 状态存在于宿主细胞中。 质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌等细胞中，它具 有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝 数，并表达所携带的遗传信息。
• 松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下
进行的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的 药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至 几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要 经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。

2011年7月
4.实验材料
对数期菌株（pEGFP-N1 in DH5α）
质粒DNA提取——碱裂解法
碱裂解法试剂配方
组分1 Ⅰ液 Ⅱ液 Ⅲ液 RNase A 洗脱液 EB 25 mM Tris-HCl （pH 8.0） 0.2 M NaOH 3 M KAc （pH 4.2） 10 μg/ml RNase A 10 mM Tris-HCl （pH 8.0） 1 mM EDTA （pH 8.0 ） 组分2 10 mM EDTA（pH 8.0 ） 1% SDS
质粒DNA提取及检测——实验准备
2011年7月
1.实验器材
台式高速离心机、旋涡混合仪、移液器、定时器、 marker笔、 电子天平、电泳设备、凝胶成像系统、微波炉、量筒、试剂瓶、锥形瓶等。
2.实验耗材
无菌2 mL/1.5 mL EP管、各规格Tip、一次性手套等。
3.实验试剂
质粒小提试剂盒（离心柱型，YRBIO) 、LB培养基、抗生素、 琼脂糖、DNA Loading Buffer、 GoldView核酸染料、 TAE电泳缓冲液等。
四．真核细胞总RNA提取
五．琼脂糖凝胶电泳

核酸简介
2011年7月
核酸是由核苷酸或脱氧核苷酸通过3′，5′- 磷酸
二酯键连接而成的一类生物大分子。包括核糖
核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两类。
DNA主要储存遗传信息。
RNA主要传递遗传信息。

EDTA：螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；
NaCl：提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中。

基因组DNA提取——SDS法
2011年7月
SDS法实验流程（以动物组织为例）
动物组织
抽提
离心洗涤
液氮研磨 或匀浆
上层溶液
干燥溶解
细胞裂解
2.实验耗材
1.5 mL EP管（RNase free）、各规格Tip （RNase free） 、 一次性手套、一次性口罩等。
3.实验试剂
TRIzol 总RNA提取试剂（YRBIO) 、氯仿、异丙醇、75%乙醇 （RNase free）、DEPC H2O （RNase free） 等。
2011年7月
RNA残留
质粒断裂
量少

质粒DNA提取常见问题分析
2011年7月
RNA残留
忘记加RNase A？
I液中RNase A失效？
酶量不够？

质粒DNA提取常见问题分析
2011年7月
质粒断裂

基因组DNA提取——SDS法
2011年7月

SDS提取缓冲液的配方
组份 终浓度 Tris-HCl （pH 8.0） 50 mM EDTA （pH 8.0 ） 20 mM NaCl 0.4 M SDS 2%
Tris-HCl（pH8.0）：提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；
DNA提取量少
实验材料不佳或量少 —— 选取新鲜（幼嫩）材料 破壁或裂解不充分 ——充分研磨、破壁酶、延长裂解时间 沉淀不完全 ——低温、延长沉淀时间 洗涤使得丢失DNA

2011年7月
2011年7月
一．核酸简介
二．基因组DNA提取
三．质粒DNA提取
液氮研磨
上层溶液
干燥溶解
细胞裂解
核酸沉淀
DNA溶液

基因组DNA提取——SDS法
2011年7月
SDS法原理
SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞， 使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖 杂质沉淀，离心后除去沉淀； 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNA。 注：SDS法适用于大部分实验材料基因组DNA提取。如动物组织、 细胞、全血、细菌、酵母等。
2011年7月
离心柱型质粒DNA提取试剂盒采用改进的SDS-碱裂
解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH
值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过漂洗 液将杂质和其它细菌成分去除，最后用低盐、高pH值的 洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。

四．真核细胞总RNA提取
五．琼脂糖凝胶电泳

质粒DNA提取
2011年7月
质粒DNA提取的方法：
碱裂解法
煮沸法

质粒DNA提取——碱裂解法原理
2011年7月

离心柱型质粒DNA提取试剂盒工作原理
可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离 心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中 的蛋白质和DNA便分离开。水相层主要为RNA，有机层主 要为DNA和蛋白质。

总RNA提取及检测——实验准备
1.实验器材
2011年7月
台式高速冷冻离心机、移液器、定时器、 marker笔、酒精喷壶、 电子天平、电泳设备、凝胶成像系统（或紫外透射仪）、紫外分光光度计、 微波炉、量筒、试剂瓶、锥形瓶等。

基因组DNA提取——CTAB法
2011年7月

组份
CTAB提取缓冲液的改进配方
Tris-HCl （pH 8.0） 100 mM EDTA NaCl （pH 8.0） 20 mM 0.4 M CTAB PVP40 β-巯基乙醇 2%（V/V）使 用前加入
终浓度
酒精沉淀
DNA溶液

基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测
2011年7月
琼脂糖凝胶电泳：
以琼脂糖凝胶作为
支持物，利用DNA分子
在泳动时的电荷效应和 分NA提取常见问题
核酸提取原理及方法
赢润生物 曾林

前言
2011年7月
核酸是遗传信息的载体，是最重要的 生物信息分子，是分子生物学研究的主要 对象，因此，核酸的提取是分子生物学实 验技术中最重要、最基本的操作 。

主要内容
2011年7月
一．核酸简介 二．基因组DNA提取 三．质粒DNA提取
琼脂糖凝胶电泳检测
质粒DNA的三种带型：
1.共价闭合环状DNA分子：质粒 双链没有断裂；超螺旋结构；泳 动速度最快； 2.半开环质粒DNA分子：质粒的 一条链断裂；松弛的环状分子； 泳动速度最慢； 3.线性DNA分子：质粒的两条链
均断裂；泳动速度居中。

质粒DNA提取常见问题
荷消失，水溶性下降。因此，在酸性酚的处理下，DNA 向疏水性的酚层移动，而RNA由于有-OH的存在有亲水性， 因此向水层移动。

2011年7月
TRIzol试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中 异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与
蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它
2011年7月
DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应 DNA降解 DNA量少

基因组DNA提取常见问题分析
2011年7月
DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应