思考题
1.为什么反应开始后，反应液必须静止，不 1.为什么反应开始后，反应液必须静止，不 能再摇动？ 2.本实验为何选择肝脏来提取琥珀酸脱氢酶？ 2.本实验为何选择肝脏来提取琥珀酸脱氢酶？ 本实验成功的关键是什么？ 3.抑制剂还可以选用什么物质？ 3.抑制剂还可以选用什么物质？ 4.利用本实验数据，说明酶竞争性抑制的特 4.利用本实验数据，说明酶竞争性抑制的特 点是什么？ 5.本实验在设计上存在某些缺陷，指出存在 5.本实验在设计上存在某些缺陷，指出存在 的缺陷与改进方案。
2.取试管5只，标号，按下表操作 2.取试管
试剂 1号管 2号管 3号管 4号管 5号管 — 0.5 2 1 0.2 0.5 0.5 1.5 1 0.2 2 0.5 — 1 0.2 0.5 2 — 1 0.2 0.25%琥珀酸 0.25%琥珀酸 0.5 钠液(ml) 钠液(ml) 0.5%草酸钠 0.5%草酸钠 液(ml) 蒸馏水(ml) 蒸馏水(ml) 肝糜液(ml) 肝糜液(ml) 甲烯蓝(ml)* 甲烯蓝(ml)* — 2 1 0.2
注*：甲烯蓝的量可以根据肝糜液制备情况进行调整。
摇匀，静置于37摄氏度的水浴中 （此后再勿摇动！！），注意观察各 管之颜色变化。记录各管颜色消退的 顺序和时间，并分析之。 若将退色的反应液震荡，颜色重新 变蓝，试分析之。
注意事项
1.肝脏一定要充分研磨至糊状，以使琥珀酸 1.肝脏一定要充分研磨至糊状，以使琥珀酸 脱氢酶尽量释放到溶液里。 2.离心时注意离心管一定要精确平衡，并将 2.离心时注意离心管一定要精确平衡，并将 重量相等的离心管对称放置。 3.离心结束后拿取离心管时动作要轻柔，不 3.离心结束后拿取离心管时动作要轻柔，不 要震荡离心管，以免肝糜液重新变浑浊。
实验
琥珀酸脱氢酶的 竞争性抑制
实验目的
1. 学习动物的处死与组织匀浆的方法。 2. 学习离心机的使用方法。 3. 进一步理解酶的竞争性抑制原理。
实验原理
1.竞争性抑制是指分子结构与底物相似的抑制剂可 1.竞争性抑制是指分子结构与底物相似的抑制剂可 与底物竞争性结合酶的活性中心，抑制酶的活性。 2.酶活性抑制剂的抑制程度取决于抑制剂与酶的亲 2.酶活性抑制剂的抑制程度取决于抑制剂与酶的亲 和力及与底物的相对比例。 3.草酸与琥珀酸分子结构相似，是琥珀酸脱氧氢酶 3.草酸与琥珀酸分子结构相似，是琥珀酸脱氧氢酶 剂。琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸。 剂。琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸。 在体内琥珀酸脱下的2H经电子传递链传递，最后 在体内琥珀酸脱下的2H经电子传递链传递，最后 与氧结合生成水，并释放出能量。在体外则可用 甲烯兰（蓝色）作为受氢体，甲氢兰接受琥珀酸 甲烯兰（蓝色）作为受氢体，甲氢兰接受琥珀酸 脱下的2H而被还原为甲烯白（无色）。在甲烯兰 脱下的2H而被还原为甲烯白（无色）。在甲烯兰 含量一定的条件下，蓝色的消褪快慢速度可指示 琥珀酸脱氢酶的活性，因此可根据蓝色消褪的时 间来判断该酶活性被抑制的程度。
酶的竞争性抑制
制作人：吴秀、魏凤麟、李庆慧
可逆性抑制剂与酶和（ 可逆性抑制剂与酶和（或）酶-底物 复合物非共价键结合
1.竞争性抑制作用的抑制剂与底物竞争结合 1.竞争性抑制作用的抑制剂与底物竞争结合 酶的活性中心 竞争性抑制作用：有些抑制剂和酶的底物 ； 结构相似，可与底物竞争酶的活性中心， 从而阻碍酶和底物结合成中间产物。 注：由于抑制剂和酶的结合是可逆的，抑 制程度取决与抑制剂与酶的相对亲和力和 制程度取决与抑制剂与酶的相对亲和力和 与底物浓度的相对比例。 与底物浓度的相对比例。
实验操作：
1.肝糜液的制备： 1.肝糜液的制备： 处死小鼠 取出肝脏，生理盐水洗净，剪碎，研至糊状 分批加入少量磷酸缓冲液（共7ml） 分批加入少量磷酸缓冲液（共7ml） 移至圆底离心管离心约5分钟（3000rpm） 移至圆底离心管离心约5分钟（3000rpm） 将上清液移至干净试管中，即为含酶的肝糜液
E+S + I Ki EI S

ES
E+P
I
2.非竞争性抑制作用的抑制剂不该变酶对底 2.非竞争性抑制作用的抑制剂不该变酶对底 物的亲和力 有些抑制剂与酶活性中心外的必需基团结 有些抑制剂与酶活性中心外的必需基团结 合，不影响酶与底物的结合，酶和底物的 结合也不影响酶与抑制剂的结合（底物与 抑制剂之间无竞争关系）。 酶-抑制剂复合物（ESI)不能进一步释放出 抑制剂复合物（ESI)不能进一步释放出 产物。
3.反竞争性抑制作用的抑制剂仅与 3.反竞争性抑制作用的抑制剂仅与 酶-底物复合物结合
反竞争性抑制作用：该抑制剂只 反竞争性抑制作用：该抑制剂只与酶合底 物形成的中间产物（ES）结合，使中间产 物形成的中间产物（ES）结合，使中间产 物的量下降。这样，即减少从中间产物转 化为产物的量，也同时减少从中间产物解 离出游离酶合产物的量。
实验器材与试剂
（一）器材 小白鼠 手术剪 研钵 手术镊子 2ml移液管 1ml离心管 2ml移液管 1ml离心管 1000ul微量可调式移液器 1000ul微量可调式移液器 低速离心机 （二）试剂 1. pH7.4磷酸缓冲液 pH7.4磷酸缓冲液 2. 0.25%琥珀酸钠溶液 0.25%琥珀酸钠溶液 3. 0.5%草酸钠溶液 0.5%草酸钠溶液 4. 0.01%甲烯兰溶液 0.01%甲烯兰溶液 5. 生理盐水