RFLP和RAPD遗传标记技术及其在昆虫学中的应用*陈 辉(西北林学院,陕西杨凌 712100) 80年代以来,伴随着分子生物学技术和生化技术的发展和完善,使生物遗传学、分子生物学、基因工程等学科的研究迅速深入,极大地丰富了人类对生命过程和本质的认识。
同时,以DNA遗传标记为代表的分子生物学研究技术,为生物分类学、系统学、遗传学、分子生态学提供了许多新的研究技术和方法,使人类可以通过对目标生物DNA分子特异位点或基因片段的分子标记,实现对生物遗传表型差异的控制、重组和鉴定,以及从分子角度研究生物生态机制。
RFLP和RAPD技术是生物DNA遗传标记中最为重要的研究手段,自诞生之日起就倍受青睐,广泛地应用于各生物类群的分子生物学研究。
然而,作为自然界种类和数量最多、生长繁殖最为迅速的昆虫,由于其种类繁多、生殖方式的多样化和多样的生存适应性变异和进化等特点,使昆虫遗传基础研究相对薄弱。
建立在DNA水平上的分子标记技术的出现,为昆虫遗传图谱的构建、系统发育关系的分析、昆虫分子适应机制的探索、昆虫抗菌多肽的鉴定、昆虫防治技术的提高以及植物抗菌基因工程的发展和应用开辟了一条新的途径。
1 RFLP标记技术原理和特点 限制性内切酶切片长度多态性(Restric-tio n Frag ment Length Po lymo rphism,简称RFLP),是指用限制性内切酶处理不同生物个体的DNA所产生的大分子片段的大小差异,这种技术是伴随分子杂交、放射性自显影技术而产生的,主要用于生物遗传连锁图的构建、遗传系谱分析和数量遗传研究等方面。
1.1 RFLP标记的原理由于生物在长期进化适应的过程中,在种、属间甚至在品种间同源DNA序列上的限制性内切酶识别位点出现差异,或者由于生物突变、重组等原因引起核苷酸发生替换、插入或缺失等,使同源生物限制性内切酶识别位点发生变化。
这样生物DNA经适当限制性内切酶切割形成长度不同的片段,加之电泳迁移率的不同,就会形成不同的DNA 片段谱带模型,通过与克隆的DNA探针进行Southern杂交和放射性显影,便能得到DNA的限制性片段多态性,从而构建生物DNA指纹图谱,为生物种、属间亲缘关系、系统发育关系和生物演化提供有力的证据。
1.2 RFLP标记的特点由于RFLP起源于生物基因组DNA的自然变异,使之一方面不受显影性关系、生物所处的生态环境和生物不同发育阶段、器官的影响,具有稳定遗传和专一性的特点;在数量上不受限制,可随机选取能代表整个基因组的RFLP标记,且每个标记变异大,检测方便;用于探测RFLP的克隆探针可随机选择,可以是核糖体DNA,也可以是总DNA。
另一方面,RFLP的等位基因具有共显性的特点,所以被广泛应用于多种生物的分析和指纹图谱的构建;RFLP具有种族特异性,对于分析一个分离群体的染色体片段具有重要Shaanxi Fo rest Science and T echnolog y陕西林业科技 N o.1,1999,pp.49～52 本文经西北农业大学袁锋教授审阅,特此致谢!价值,RFLP也是进行有益基因的分子标记定位、数量性状微效基因的质量化、杂交优势的理论探讨和预测的有效手段,为昆虫生理学、昆虫分子生物学和昆虫分子生态学的研究提供了新的技术。
但是,RFLP标记也有其不足,主要表现在大分子染色体DNA标记时,各种长度的DNA片段在电泳胶片上相互交盖,连成一片不能分辨,所以必须借助分子杂交手段,将某一标记的DNA片段作为探针进行分子杂交,使与探针有同源性的片段实现检测,这样造成RFLP技术操作复杂繁琐和放射性危害。
目前人们正在致力于寻找多功能的探针并试图将PCR和RFLP技术结合,使识别后的基因片段扩增以获得清晰的DNA谱带。
2 RA PD标记的原理和特点随机扩增多态DNA(Random Amplified Po lymo rphic DNA,简称RAPD)是J. Williams和J.Welsh两个研究小组于1990年同时提出的一种随机引物扩增,寻找多态DNA片段的遗传标记技术,它是建立在PCR技术基础上,以随机的寡聚脱氧核苷酸作为PCR反应引物,对基因DNA进行扩增而显示DNA图谱和对物种进行亲缘关系、系统发育分子水平的鉴别,以及分子生物学、分子生态学的研究。
2.1 RAPD标记的原理RAPD标记是以人工合成的各种核苷酸为引物,在一种热稳定DNA多聚酶(T aq po lymerase)的作用下,通过DNA多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reactio n,简称PCR)技术扩增DNA片段,用电泳分离各种不同引物诱导产生的各种长度的DNA后,根据生物产生的DNA多态性进行分析和鉴定。
2.2 RAPD标记的特点RAPD标记的一个明显的特点使RA PD引物无特异性,可以用未知序列的基因组DNA作为模板,通过PCR扩增获得一组不连续的DNA片段,且RAPD所需引物较短,10个左右的寡核苷酸即可,引物可以人工合成,也可以购买现成的商品;其次,一套引物可用于不同生物,建立一套标准引物,便可用于生物种内多态性鉴定。
由于DNA 扩增仪的使用,使操作自动化程度高,分析量大,免去了RFLP中制备探针、同位素标记、Southern印迹法及分子杂交等步骤,从而构成了RAPD分析速度快,所需DNA样品少等优点。
尤其使RAPD标记可以在对生物种没有任何分子生物学研究基础的情况下,对物种进行基因组DNA指纹图谱的构建。
但是,由于RAPD是一种显性标记,所以不能区分一个位点扩增的DNA片断是纯合的还是杂合的。
另外,RAPD标记技术的再现性差,这就要求研究者对不同物种作大量的摸索工作,以确定每一物种的最佳引物和实验条件。
3 R FL P和RA PD标记技术在昆虫学研究上的应用 由于RFLP和RAPD遗传标记技术的众多优点,使之一出现就引起广泛的重视,并被广泛的应用于生物学各研究领域。
Welsh (1991)用三个引物对白鼠8个品系进行多态性分析;Shuichi(1992)研究11个水稻品系的RAPD扩增片段的多态性,并获得11个品系的相对遗传距离;Halw ard(1992)用RA PD研究花生品系之间进化的关系。
3.1 DNA遗传标记在昆虫分类学中的应用物种的进化本质是基因的进化,所以分子分类学(M olecular Systematics)可以在DNA水平上更准确地甚至是定量地分析物种的进化程度、遗传距离和系统发育。
Black 等(1992)首先将RAPD技术用于4种蚜虫的鉴别比较,他们采用4种10个碱基的随机50陕西林业科技1999年第1期引物对四种蚜虫进行RAPD反应,检测其扩增产物的多态性。
结果表明:根据电泳谱带可以区分四个种。
同时,检测种内不同生物型以及同一生物型内不同个体扩增产物的多态性,种群内不同个体之间扩增产物的多态性。
另外,Black等用RAPD技术检测和鉴定了蚜虫体内的两种寄生蜂,并对RAPD寄生的可靠性等作出了有价值的评价。
Black等(1993)应用RDNA的IGS基因探针进行RFLP分析,对目前已知的杂食性麦蚜9个小种(A—1)的生化型作了鉴别,证实了美洲食麦蚜起源于欧亚大陆,解决了美州食麦蚜与欧亚大陆食麦蚜之间的亲缘关系。
Osaka-ba等(1994)利用rDNA在进化上的保守性,将哺乳动物小鼠的rDNA用于珠形蟥(Panonychus)3个近缘种的系统关系的研究,证明了P.mor i与P.citri亲缘关系十分接近,为两个独立的种。
3.2 DN A遗传标记技术在昆虫分子生态学研究中的应用分子生态学是从基因水平研究生物之间的关系和生物与环境之间的关系。
目前, DNA遗传标记技术已被用于昆虫个体遗传标记;昆虫生殖策略、种群间迁移扩散关系、种群内遗传变异程度和种群间遗传分化程度的研究。
Blanchetot(1992)利用M13噬菌体DNA 探针和珠蛋白基因重复序列探针,研究苜蓿切叶蜂(Megachile r otund ata)的生殖策略,证明了每巢中的后代基本来自单一雌性,且在大多数情况下雌性只与单一雄性交配。
Lu (1994)将DNA重复序列标记技术应用于秋粘虫(S p odop ter a f r agip er da)的研究。
该物种两个种群的分布区有部分重叠,其中一个种群嗜食玉米,另一个种群则以水稻和饲料用草为食。
结果表明:DNA重复序列标记技术能将两个在形态上无法区分的种群完全的划分开。
同时,对秋粘虫种群迁飞、种群结构和生殖行为等也作了研究。
3.3 DNA遗传标记在害虫防治中的应用DNA遗传标记技术为揭示有害昆虫食物链各环节的相互关系提供了一种有效的分析方法和技术,使人们能够从生物之间营养、能量、信号的相互制约和依赖关系达到对目标昆虫种群的控制。
Blanchetot(1993)利用DNA遗传标记技术研究了非洲稚虫和中间寄主非洲舌蝇之间的遗传依赖关系,以及非洲舌蝇自交系和基因连锁图谱,为非洲舌蝇的生物防治靶目标的设计提供了依据。
Raymo nd(1991)用此技术研究了库蚊(Culex p ip iens)对有效磷农药抗性产生和扩散的机制,证明导致库蚊抗性产生的酯酶B2基因的扩散具有单一起源,并通过迁飞扩散到不同地区。
此外,国内外众多研究者将DNA遗传标记技术应用于昆虫对化学农药的敏感和抗性基因的筛选、昆虫抗药性产生的机制、害虫的基因防治、抗虫基因植物的人工构建等多方面。
Rohm(1987)利用T i质粒为载体成功地将苏云金杆菌的 内毒素基因(Bt基因)转入烟草中;Davis(1989)和McCow n(1991)将抗虫Bt基因导入番茄和杨树中;卞学渝、韩一凡(1997)利用RAPD技术对杨树抗云斑天牛基因连锁标记筛选,为抗虫植物的人工构建奠定了基础。
3.4 DNA遗传标记技术在昆虫分子生物学中的应用由于昆虫分子生物学是从基因或分子水平研究和揭示昆虫生长、繁殖以及种群构成的机制,所以RFLP和RAPD标记技术在昆虫分子生物学中得到广泛的应用。
Benedict(1993)用果蝇Hsp70基因编码区为遗传标记探针,克隆了中美洲疟蚊(A nop heles albimanus)的热休克基因,从基因与昆虫谷胱甘肽S转氨酶的活性研究了昆虫对杀虫剂的抗药性。
Kum ar(1995),M ckey511999年第1期陕西林业科技(1995)和Salazr(1994)分别利用RAPD技术对蚊虫酯酶基因、淀粉水解酶基因和5SRNA基因、果蝇蛋白质二硫键异构酶 基因和按蚊细胞骨架肌动蛋白质基因进行了定位研究。
Skinner(1991)用DNA遗传标记技术从烟草天蛾(Manduca sex ta)、甜菜夜蛾(Sp odop tera ex igue)、烟芽夜蛾(H elothis Virescens)的血淋巴中分离到7种麻痹多肽的基因;Maeda(1989)、Eldridg e(1992)已将昆虫利尿激素基因和保幼激素酶基因用于基因工程杆状病毒;Kaw ano(1992)从家蚕和美洲棉铃虫中分离到两种激活性外激素生物合成神经肽的基因。