实验名称:液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）的各种模式探索一、实验目的1、了解LC-MS的主要构造和基本原理；2、学习LC-MS的基本操作方法；3、掌握LC-MS的六种操作模式的特点及应用。
二、实验原理1、液质基本原理及模式介绍液相色谱-质谱法（Liquid Chromatography/Mass Spectrometry，LC-MS）将应用范围极广的分离方法——液相色谱法与灵敏、专属、能提供分子量和结构信息的质谱法结合起来，必然成为一种重要的现代分离分析技术。
但是，LC是液相分离技术，而MS是在真空条件下工作的方法，因而难以相互匹配。
LC-MS经过了约30年的发展，直至采用了大气压离子化技术（Atmospheric pressure ionization，API）之后，才发展成为可常规应用的重要分离分析方法。
现在，在生物、医药、化工、农业和环境等各个领域中均得到了广泛的应用，在组合化学、蛋白质组学和代谢组学的研究工作中，LC-MS已经成为最重要研究方法之一。
质谱仪作为整套仪器中最重要的部分，其常规分析模式有全扫描模式（Scan）、选择离子监测模式（SIM）。
（一）全扫描模式方式（Scan）：最常用的扫描方式之一，扫描的质量范围覆盖被测化合物的分子离子和碎片离子的质量，得到的是化合物的全谱，可以用来进行谱库检索，一般用于未知化合物的定性分析。
实例：（Q1 = 100-259m/z）（二）选择离子监测模式（Selective Ion Monitoring，SIM）：不是连续扫描某一质量范围，而是跳跃式地扫描某几个选定的质量，得到的不是化合物的全谱。
主要用于目标化合物检测和复杂混合物中杂质的定量分析。
实例：（Q1 = 259m/z）本实验采用三重四极杆质谱仪（Q1：质量分析器；Q2：碰撞活化室；Q3：质量分析器），由于多了Q2、Q3的存在，在分析测试的模式上又多了四种选择：（三）子离子扫描模式（Product Scan）：第一个质量分析器固定扫描电压，选择某一质量离子（母离子）进入碰撞室，发生碰撞解离产生碎片离子，第二个质量分析器进行全扫描，得到的所有碎片离子都是由选定的母离子产生的子离子，没有其它的干扰。
主要用于化合物结构分析。
实例：（Q1 = 259m/z；Q3 = 100-259m/z）（四）母离子扫描模式（Precursor Scan）：第一个质量分析器扫描电压选择母离子（如分子离子），进入碰撞室碰裂后，第二个质量分析器固定扫描电压，只选择某一特征离子质量，该特征离子是由所选择的母离子产生的，由此得到所有能产生该子离子的母离子谱。
主要用于同系物的分析。
实例：（Q1 = 100-300m/z；Q3 = 259m/z）（五）中性丢失扫描模式（Neutral Loss）：第一个质量分析器扫描所有离子，所有离子进入碰撞室碎裂后，第二个质量分析器以与第一个质量分析器相差固定质量联动扫描，检测丢失该固定质量中性碎片（如质量数15、18、45）的离子对，得到中性碎片谱。
主要用于中性碎片的分析。
实例：（Q1 = 100-300m/z；Q3 = 82-282m/z）（六）多反应监测模式（MRM）：第一个质量分析器选择一个（或多个）特征离子，经过碰撞解离，到达第二个质量分析器再进行选择离子检测，只有符合特定条件的离子才能被检测到，因为是两次选择，比单四极质量分析器的SIM 方式选择性、排除干扰能力、专属性更强，信噪比更高。
主要用于定量分析。
实例：（Q1 = 259m/z；Q3 = 138m/z）2、实验内容简介邻苯二甲酸酯(简称PAEs)是一类重要的环境内分泌干扰物，常被用作塑料的增塑剂，也可用作农药载体。
近年来，随着工业生产和塑料制品的广泛使用，邻苯二甲酸酯不断进入环境，普遍存在于土壤、底泥、大气、水体和生物体等环境样品中，成为环境中无所不在的污染物。
据报道，邻苯二甲酸酯类具有较弱的环境雌激素成分，具有影响生物体内分泌和导致癌细胞增殖的作用。
环境内分泌干扰物是指能改变机体内分泌功能，并对机体、后代或（亚）种群产生有害效应的环境物质。
由于环境内分泌干扰物对人和动物有种种不良影响，对环境内分泌干扰物的研究已成为国际关注的焦点。
我国也正在逐渐重视有关环境内分泌干扰物的研究。
三、仪器与试剂1、仪器液相系统：Varian Pro Star；自动进样器：Varian 410自动进样器；质谱仪：Varian 310 LC-MS/MS三重四极杆质谱仪（ESI离子源）；色谱柱：Varian Inertsil 3 ODS-3（150mm×2mm，3μm）。
2、试剂甲醇：HPLC色谱纯；超纯水：Millipore Express超纯水系统制备；标准溶液：用甲醇配制邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)混合标准溶液（0.1ppm）。
四、实验步骤1、条件设置色谱条件：流动相（90%甲醇+10%水）；流速（0.2ml/min）；扫描时间（7min）；离子源模式：电喷雾电离（ESI），正离子模式；扫描条件：Detector：1000V；Needle：5000V；Shield：600V；Spray Chamber Temperature：50℃；Nebulizing Gas Pressure：55psi；Drying Gas Pressure：18psi，Drying Gas Temperature (℃)：250℃，Capilary Voltage 30(V)，Coll.Energy 30(v)；质量分析器：三重四极杆；进样体积：10ul。
2、实验测定按实验操作规程完成仪器开机、参数设置及测定。
根据表1中的数据，设置m/z，选择各种扫描模式（全扫描、选择离子扫描、子离子扫描、母离子扫描、多反应监测模式）进行测定。
表1 待测物质的母离子和主要子离子DMP DEP DBP母离子（m/z）195.1 223.1 279.1子离子（m/z）163.1 149.1 149.1五．数据处理与法分析（1）全扫描模式方式（Scan）此色谱图即为全扫描模式下测得的，样品为含三种物质的混合溶液，分别为邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)，从图中我们就可以看出，仪器噪音很大，三种组分的分离效果很差，但是在定性上还是不错的，可以检测到这三种组分。
（2）选择离子监测模式（Selective Ion Monitoring，SIM）由以上色谱图，采用的是选择离子监测模式检测，分别选定了质荷比为223和279两个离子，它们分别是DEP和DBP各得到了一个氢的分子离子峰，该模式可用于选定的物质的定性分析，从以上图中的信噪来看，相比于Scan模式来说，SIM模式用来进行定性分析更好。
（3）子离子扫描模式（Product Scan）子离子扫描模式的第一个质量分析器固定扫描电压，选择某一质量离子（母离子）进入碰撞室，发生碰撞解离产生碎片离子，第二个质量分析器进行全扫描，得到的所有碎片离子都是由选定的母离子产生的子离子，没有其它的干扰，主要用于化合物结构分析。
以下就是选择质量为195的母离子进入碰撞室，解离产生碎片离子产生的谱图：以上为选择质量为195的母离子进入碰撞室，解离产生碎片离子177和149，其所得的碎片都是由选定的母离子产生的，碎裂方式有可能为：通过这样的子离子扫描，便可有助于判断选定的母离子的结构，即通过其丢失的碎片便知其部分结构。
（4）母离子扫描模式（Precursor Scan）母离子扫描模式的第一个质量分析器扫描电压选择母离子（如分子离子），进入碰撞室碰裂后，第二个质量分析器固定扫描电压，只选择某一特征离子质量，该特征离子是由所选择的母离子产生的，由此得到所有能产生该子离子的母离子谱，主要用于同系物的分析。
（5）多反应监测模式（MRM）以上为多反应监测模式的色谱图，其实质是经过两次的离子选择，即第一次选择一个特征离子，接着再对它所产生的特征碎片进行检测，其优点是选择性很强，就比如可能第一次选择时的离子可能有不止一种物质会产生，而当第二次选择时，选择目标物质所产生的区别于其它物质的碎片离子，这样便可进行特定物质的专属检测，信噪比在所有模式当中最强，如这里的信噪比S/N=2734,比前面几种模式的信噪比强很多，所以MRM模式相对于其他几种模式来说更实用。
五、思考题1、各扫描模式中m/z分别如何设定？答： 全扫描模式方式（Scan）：扫描的质量范围覆盖被测化合物的分子离子和碎片离子的质量，得到的是化合物的全谱，可以用来进行谱库检索，一般用于未知化合物的定性分析。
选择离子监测模式（Selective Ion Monitoring，SIM）：不是连续扫描某一质量范围，而是跳跃式地扫描某几个选定的质量，得到的不是化合物的全谱。
主要用于目标化合物检测和复杂混合物中杂质的定量分析。
③子离子扫描模式（Product Scan）：先选定某一特定质量的母离子，再将其打碎，得到的所有碎片离子都是由选定的母离子产生的子离子，没有其它的干扰。
主要用于化合物结构分析。
④母离子扫描模式（Precursor Scan）：先选择母离子（如分子离子），进入碰撞室碰裂后，再固定扫描电压，只选择某一特征离子质量，该特征离子是由所选择的母离子产生的，由此得到所有能产生该子离子的母离子谱。
主要用于同系物的分析。
⑤中性丢失扫描模式（Neutral Loss）：先选择所有离子，所有离子进入碰撞室碎裂后，第二个质量分析器以与第一个质量分析器相差固定质量联动扫描，检测丢失该固定质量中性碎片（如质量数15、18、45）的离子对，得到中性碎片谱。
主要用于中性碎片的分析。
⑥多反应监测模式（MRM）：先选择一个（或多个）特征离子，经过碰撞解离，到达第二个质量分析器再进行选择离子检测，只有符合特定条件的离子才能被检测到，因为是两次选择，比单四极质量分析器的SIM方式选择性、排除干扰能力、专属性更强，信噪比更高，主要用于定量分析。
2、比较各模式的测定结果，讨论各模式在测定中的作用。
答：从实验结果中，我们可以得知，Scan模式的信噪比相对于ＭＲＭ模式来说比较低，比较适用于未知物的定性分析，而ＭＲＭ用来定量分析比较有效果，以下是几种模式的定性或定量分析的方式及应用：（1）全扫描模式方式（Scan）：最常用的扫描方式之一，扫描的质量范围覆盖被测化合物的分子离子和碎片离子的质量，得到的是化合物的全谱，可以用来进行谱库检索，一般用于未知化合物的定性分析。
（2）选择离子监测模式（Selective Ion Monitoring，SIM）：不是连续扫描某一质量范围，而是跳跃式地扫描某几个选定的质量，得到的不是化合物的全谱。