实验四免疫学实验一、机体体液免疫功能测定（一）凝集反应【目的】了解玻片凝集试验、试管凝集试验及胶乳间接凝集抑制试验的操作过程、结果分析和实际应用。
【原理】颗粒性抗原(细菌、细胞等)与相应抗体在一定电解质存在的条件下发生特异性结合并出现肉眼可见的凝集块的现象称为凝集反应。
凝集反应既可用已知抗体检查和鉴定未知的抗原(如鉴定细菌)，也可用已知抗原检查血清中相应的抗体；既可用作定性检测，又可用于定量检测。
凝集反应分两种。
一种是颗粒性抗原与抗体直接结合出现的凝集现象，称为直接凝集反应；另一种是将可溶性抗原吸附于一种与免疫无关的载休颗粒表面，再与相应的抗体结合而出现的凝集反应，称为间接凝集反应。
如将抗体吸附于载体颗粒表面，再与相应的抗原结合而出现的凝集反应则称为反向间接凝集反应。
1、玻片凝集反应【材料】伤寒诊断血清、伤寒沙门菌及大肠埃希菌培养物、载玻片、生理盐水等。
【方法】①取载玻片1张，左侧加生理盐水1滴，中间及右侧各加伤寒诊断血清1滴；②用接种环取伤寒沙门菌培养物少许，分别与盐水及中间的伤寒诊断血清混匀。
同法取大肠埃希菌培养物与右侧伤寒诊断血清混匀；③轻轻摇动玻片1～2min后，观察结果；④观察后，将玻片直接投入消毒缸，不要冲洗，以防污染。
【结果】出现凝集物者为阳性反应，均匀混浊无凝集物者为阴性反应。
【注意事项】玻片凝集反应①用接种环取一种试剂前后均需进行烧灼，不可有杂菌污染以及前一试剂残留。
②用接种环取细菌时应先烧灼灭菌，待冷却后方可挑取细菌。
③用接种环加细菌于血清中后，应先烧灼接种环，再取细菌加入另一血清中。
【结果分析】左：中：右：应用：2、试管凝集反应试管凝集反应为半定量试验，常用已知抗原检测患者血清中相应抗体的效价。
【材料】伤寒诊断血清(抗体)、伤寒菌液(抗原)、生理盐水(NS)、刻度吸管、试管等。
【方法及结果】见表试管凝集反应的方法试管 1 2 3 4 5 67生理盐水(ml) 0.9 0.5 0.5 0.5 0.5 弃去0.50.5伤寒诊断血清(ml) 0.1 0.5 0.5 0.5 0.50.5 ＋NS 0.5血清稀释倍数1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320对照菌液(ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.50.5血清最终稀释倍数1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640对照56℃ 4小时,4℃冰箱过夜,次日观察结果结果效价【结果判断】见表手持试管，对光观察管内液体混浊度及管底沉淀物之性状。
试管凝集反应结果的判读记录符号上层液体管底凝集物++++ 完全澄清凝块多而明显，全部沉于管底+++ 微混浊凝块显著，大部分沉于管底++ 稍混浊凝块较明显，中等沉于管底+ 混浊凝块不太明显，少许沉于管底- 混浊细菌均沉积于管底，呈小园点状，不见凝块凝集效价的判定：呈“++”阳性反应的最高稀释倍数为该血清的效价(也称滴度)。
对照管(第7管)应为阴性。
【注意事项】观察结果时，先看生理盐水对照管，可见管底有圆点状细菌沉积，边缘整齐，轻摇则分散为混浊的菌液，似烟雾状。
【思考题】试管凝集反应的临床应用：（二）沉淀反应可溶性抗原(如血清、细菌浸出液、毒素等)和相应抗体结合，在适量电解质存在的条件下，经一定时间，二者在比例适当时形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。
参与反应的抗原称为沉淀原，而相应的抗体称为沉淀素。
由于沉淀反应的抗原多系胶体溶液，沉淀物主要是由抗体蛋白所组成，为获得抗原与抗体的适宜比例，操作中通常稀释抗原而不稀释抗体，并以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价。
本实验介绍琼脂扩散试验和对流免疫电泳。
【目的】了解单扩、双扩及对流免疫电流的原理、操作步骤及临床应用。
1、单向琼脂扩散试验：【原理】琼脂属于大分子多糖，100℃时熔化，低于45℃时凝固而形成网状结构，并能允许抗原抗体的在其中自由扩散。
琼脂扩散试验是指可溶性抗原与相应抗体在琼脂内扩散，若二者对应且比例合适，则出现白色沉淀物。
单向琼脂扩散试验系定量试验，通常以已知抗体测定未知抗原。
试验中将定量的抗体混合于琼脂内倾注于玻片上制成琼脂板，凝固后打孔。
再将待检抗原加入孔中，因抗体与琼脂混合凝固后，不会再扩散，只有孔中抗原向四周扩散，抗原、抗体在比例适合处可形成白色沉淀环。
由于只有抗原扩散故称之为单向扩散。
沉淀环的直径大小与抗原浓度成正比。
以不同浓度的标准抗原与固定浓度的抗血清反应后测得沉淀环的直径作纵座标，以抗原浓度为横座标，绘制标准曲线。
测量待检抗原的沉淀环直径，从标准曲线中求得其含量。
本试验主要用于检测标本中各种免疫球蛋白或血清补体含量。
目前也常采用血清全自动分析仪检测各种免疫球蛋白或血清补体含量。
【材料】①人免疫球蛋白IgG的诊断血清(冻干羊抗人IgG即抗体)。
②人免疫球蛋白标准血清（抗原），待检人血清（抗原）。
③打孔器、加样器、37℃恒温箱、1.8％琼脂玻片等。
【方法】①制板：按抗血清效价的一半，用56℃预热的生理盐水稀释抗血清，再加入等量的冷却至56℃的琼脂轻轻混匀，灌板(3ml/板)。
②打孔：以打孔器打孔，孔径3mm，孔距1cm，每板2排，每排5个孔，用针头把孔内琼脂块挑出。
③按说明书要求稀释标准血清与待检血清。
待检血清1：50稀释，标准血清系列稀释至：1:12.5，1:25，1:50，1:100，1:200。
④加样：用微量加样器在第1排孔中依次加入不同稀释度的人标准血清各10μl，第二排相邻两孔中加待检血清各10μl。
⑤将琼脂板放入湿盒，37℃24h后测各沉淀环直径。
单扩标准孔示意图单扩标准曲线示意图⑥以沉淀环直径为纵座标，相应孔的IgG含量为横座标，在半对数纸上制作标准曲线。
根据待检血清沉淀环直径查标准曲线，将查得的IgG含量乘以标本的稀释倍数即为待检血清中的IgG含量。
【注意事项】①灌板时，一定要将抗血清56℃预温(但不要超过56℃，否则会破坏抗血清)，再与冷却至56℃的琼脂混匀，迅速灌板(所灌板应厚薄一致，无气泡)。
②加样要准确、均一，打孔时孔距不能小于1cm。
【结果观察记录】绘图。
单扩实验结果【临床应用】：2、双向琼脂扩散试验【原理】双向琼脂扩散试验为定性试验。
将可溶性抗原与相应抗体分别加入琼脂板上相对应的孔内，两者相互扩散，在比例适宜处形成沉淀线。
如抗原与抗体无关则无沉淀线出现。
本试验常用于分析抗原抗体的纯度与相互关系。
临床上曾经用于检测甲胎蛋白(AFP)，作为原发性肝癌的辅助诊断。
【材料】①甲胎蛋白免疫血清。
②脐带血血清，待检血清。
③玻片、琼脂、打孔器、加样器等。
双向琼脂扩散【方法】①制板：将已熔化的1.8％盐水琼脂倒在玻片上，3ml/板。
②打孔：用打孔器照图1-8打孔。
③加样：中央孔加甲胎蛋白免疫血清，1和4孔加脐带血血清，其它孔内加待检血清，每孔均加10μl（。
④将琼脂板置于湿盒内，37℃ 24h后观察结果。
【结果及绘图】待检标本如出现沉淀线，且与阳性对照的沉淀线相吻合，则为阳性反应。
如无沉淀线出现或与阳性对照沉淀线完全交叉则为阴性反应。
双扩沉淀线类型①表示两种抗原完全相同；②表示两种抗原完全不同；③表示两种抗原部分相同【注意事项】①加样时注意不要划破琼脂，以免影响沉淀线形状。
②反应时间要适宜。
时间过长，沉淀线可解离致假阴性；时间过短，则沉淀线不出现。
③加样时，抗体、阳性血清及待检标本应各用一支加样器，以免混淆，影响实验结果。
④沉淀线出现的位置及沉淀线是否弯曲均有不同意义，应注意分析。
【结果分析】：（三）补体溶血试验【目的】了解补体溶血试验的原理、方法和应用。
【原理】补体是具有酶活性的一组球蛋白，不耐热，56℃ 30min即被破坏。
其作用没有特异性，能与任何抗原抗体复合物结合，但不能单独与抗原或抗体结合。
实验室常用豚鼠的新鲜血清作为补体的来源。
当用红细胞免疫动物后，动物免疫血清中即含有特异性抗体(溶血素)，若红细胞与相应抗体结合而有补体存在时，则红细胞被溶解，此为溶血反应。
本反应通常作为补体结合反应的指示系统。
临床上如发生输血错误，也可出现溶血反应。
【材料】①溶血素(抗体)、2％绵羊红细胞悬液(抗原)、补体。
②生理盐水、小试管、吸管、37℃水浴箱。
【方法】①取小试管5支，分别注明管号，按表1-4依次将各成分加入前4支试管中。
溶血反应加样程序1（ml）试管号 1 2 3 4 2％绵羊红细胞0.5 0.5 0.5 0.5溶血素(2个单位) 0.5 0.5 - -补体(2个实用单位) 0.5 - 0.5 -生理盐水0.5 1.0 1.0 1.5②混匀试管内容物，将4支试管置37℃水浴15～30min，观察有无溶血现象，若红细胞溶解，则由红色的细胞混浊液变为红色透明液体。
③将不溶血试管的第2、3管低速离心3～5min，使红细胞沉淀，用滴管将上清液与沉淀物分开（第1管出现溶血，第4管不溶血）。
④将第2管上清液用毛细管吸入第4管，将第3管上清液倒入第5管，然后再按表加入各物。
⑤混匀后，将上述第2、3、4、5号试管置37℃水浴15～30min后，观察结果。
溶血反应加样程序2（ml）试管号 2 3 4 5内容物第2管沉淀物第2管沉淀物第2管上清液第2管上清液2％绵羊红细胞- - 0.5 0.5溶血素(2个单位) - 0.5 - 0.5补体(2个实用单位) 0.5 - 0.5 -生理盐水 2.5 2.5 - 2.0结果溶血不溶血不溶血溶血【结果】第2、5号试管出现溶血，第3、4号试管不出现溶血。
【分析】试管1：试管2：试管3：试管4：试管5：【思考题】补体有何生物学功能，本实验揭示其何种功能?二、机体细胞免疫功能测定【目的】了解E 玫瑰花结试验、淋转试验的原理、方法、结果观察及意义。
（一）E 玫瑰花结试验(总T-花结形成试验)【原理】人外周血T 淋巴细胞表面具有绵羊红细胞(SRBC)受体，在体外一定条件下，当T 细胞与SRBC 混合时，可形成以T 细胞为中心，四周环绕SRBC 的花结。
E 花结的形成是T 细胞独特的标志。
E 花结形成试验最常用的是总E 花结试验和活性E 花结试验。
总E 花结试验代表被检标本T 淋巴细胞的总数和百分率；而活性E 花结试验反映的是对SRBC 具有高度亲和力的T 细胞亚群，该亚群T 细胞与T 细胞的体内外功能活性有密切关系，在一定程度上反映机体细胞免疫功能。
【结果观察】绘图(E –玫瑰花结形成细胞)。
（二）淋巴细胞转化试验【原理】T 淋巴细胞在PHA 的刺激下可转化为淋巴母细胞，转化过程中的物质基础是淋巴细胞核DNA 的合成，DNA 特有的组成成分是胸腺嘧啶核苷，人工将胸腺嘧啶核苷用同位素3H-TdR 标记，通过计数淋巴细胞内的放射性就可推知淋巴细胞的转化程度。
【结果观察】⑴用形态学检查转化的淋巴母细胞形态特征：①母细胞：体积明显增大，为成熟淋巴细胞的3～4倍(成熟的淋巴细胞直径约6～10μm )。