琼脂糖凝胶电泳
1.原理
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。

其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。

琼脂糖凝胶具备网络结构，物质分子通过时会受阻力，大分子物质在汹涌时受的阻力小，因此在凝胶电泳中，磁铁颗粒的拆分不仅依赖于天量电荷的性质和数量，而且还依赖于分子大小，这就大大提高了辨别能力。

但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广为应用于核酸的研究中。

蛋白质和核酸会根据ph不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。

电泳缓冲液的ph在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。

常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。

琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的dna片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。

普通琼脂糖凝胶分离dna的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的dna片段。

dna分子在琼脂糖凝胶中泳动时存有电荷效应和分子筛效应。

dna分子在低于等电点的ph溶液中带负电荷，在电场中向负极移动。

由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链dna几乎具备等量的净电荷，因此它们能够以同样的速率向负极方向移动。

2操作方式流程
准备干净的配胶板和电泳槽
琼脂糖凝胶电泳：水平电泳
注意dna酶污染的仪器可能会降解dna，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象。

(1)电泳方法
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一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大dna链应该使用脉冲凝胶电泳。

注意巨大的dna链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。

(2)凝胶浓度
对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2%之间，低浓度的用以展开大片段核酸的电泳，高浓度的用以展开大片段分析。

低浓度胶坚硬，小心操作方式和采用质量不好的琼脂糖就是解决办法。

特别注意高浓度的胶可能将并使分子大小相似的dna拎难于辨别，导致条带缺位现象。

(3)缓冲液
常用的缓冲液有tae和tbe，而tbe比tae有着更好的缓冲能力。

电泳时使用新制的
缓冲液可以明显提高电泳效果。

注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，ph值上升，缓冲性能下降，可能使dna电泳产生条带模糊和不规则的dna带迁移的现象。

三羟甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)aminomethane，通常缩写为tris）就是一
种有机化合物，其分子式为(hoch2)3cnh2。

tris被广为应用于生物化学和分子生物学实验中的缓冲液的制取。

比如，在生物化学实验中常用的tae和tbe缓冲液（用作核酸的熔化）都须要使用tris。

(4)电压和温度
电泳时电压不应该超过20v/cm，电泳温度应该低于30℃，对于巨大的dna电泳，温
度应该低于15℃。

注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的
dna带迁移的现象。

特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象
(5)dna样品的纯度和状态
注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。

乙醇沉
淀可以去除多余的盐，用酚可以去除蛋白。

注意变性的dna样品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的dna条带迁移。

在上样前不要对dna样品加热，用20mmnacl缓冲液
稀释可以防止dna变性。

(6)dna的上样
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正确的dna上样量是条带清晰的保证。

注意太多的dna上样量可能导致dna带型模糊，而太小的dna上样量则导致带信号弱甚至缺失。

(7)marker的选择
dna电泳一定必须采用dnamarker或未知大小的也已对照dna去估算dna片段大小。

marker必须挑选在目标片段大小附近ladder成株的，这样对目标片段大小的估算才比较
精确。

须要特别注意的就是marker的电泳同样也必须合乎dna电泳的操作方式标准。

如
果挑选λdna/hindiii或者λdna/ecori的酶乌marker，须要预先65℃冷却5min，冰上
加热后采用。

从而防止hindiii或ecori酶乌导致的粘性接点引致的片段相连接圆形或条
带信号强等现象。

(8)凝胶的染色和观察
实验室常用的核酸染色剂就是溴化乙锭（eb），染色效果不好，操作方式便利，但是
稳定性高，具备毒性。

特别注意观测凝胶时应根据染料相同采用最合适的光源和唤起波长，如果唤起波长不对，条带则难于观测，发生条带模糊不清的现象。

3废旧编辑
(1)dna片段的胶回收方法
电泳洗清法
低熔点琼脂糖凝胶电泳挖块法冻融回收法玻璃奶回收法柱回收法(2)胶回收注意事项
a.将电泳槽用ddh2o反反复复冲洗整洁，放入新鲜酿制的杀菌电泳缓冲液；
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b.根据点样量制取最合适厚度的琼脂糖凝胶板；
c.切胶时尽可能包住C99mgdna片段的凝胶；
d.要尽量减少dna在紫外下的照射时间以减少对dna的损伤；
e.熔胶要完全。

loadingbuffer
loadingbuffer的中文名字叫上样缓冲液，6*的缓冲液中可以显示两条带，前面的紫兰色的条带是溴酚蓝，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与1kb、0.6kb、0.2kb和0.15kb的双链线性dna片段大致相同；后面的兰色条带是二甲苯青，它在1%和1.4%琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与2kb和1.6kb的双链线性dna 大致相似。

而对于page胶他们的迁移速率也分别不同。

1.主要用途
loadingbuffer的功能主要存有两个：
第一，里边的指示剂溴酚蓝和二甲苯青ff起到指示的作用，显示电泳的进程，以便我们适时终止电泳；
第二，里边的成分甘油可以加强样品密度，并使样品密度大于tae，从而下陷至点样孔中，避免样品飞出点样孔。

另外，有的buffer是加有sds的，一般都会写明。

sds主要是促使聚合酶变性，因为没有除尽的聚合酶会结合在dna双链上影响它的迁移速率。

细胞裂解后的裂解液，加loading100℃加热，也是为了中止酶促反应，防止提取的蛋白质降解。

2.制备方法
loadingbuffer通常布局：(1)6×loadi ngbuffer:30mmedta36%(v/v)glycerol
0.05%(w/v)xylenecyanolff0.05%(w/v)bromophenolblue主要用于dna电泳
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(2)10×loadingbuffer:30mmedta50%(v/v)glycerol
0.25%(w/v)xylenecyanolff0.25%(w/v)bromophenolblue主要用作rna电泳
注：（1）10×loadingbuffer中仅有色素溴酚蓝（bromophenolblue)一种染料（浓度0.05%）；
（2）6×loadingbuffer中不含色素溴酚蓝（bromophenolblue)、二甲苯青蓝ff （xylenecyanolff)两种染料（浓度都就是0.05%）
在琼脂糖凝胶（0.5%~1.4%）中溴酚蓝（bromophenolblue）约与300bp的双链线状dna的迁移速度相同，二甲苯腈蓝ff则与4kbp的双链线状dna的迁移速度相等。

6×loadingbuffer就是用以上样的；10×loadingbuffer就是stopbuffer，就是暂停酶促发展反应的，如果一定会用10×loadingbuffer的上样当然也可以，唯一必须特别注意的就是：10×loadingbuffer中多了一样sds，它可以并使酶类如taq酶变性，以pcr 产物为基准，在电泳泳道上可以产生一片云气，如果电泳走的距离长，和多出一条拎没什么区别（大概1000bp左右）。

(3)5×sds-pageloadingbuffer配制方法组份浓度：
250mmtris-hcl（ph6.8）10%（w/v）sds0.5%（w/v）bpb50%（v/v）甘油5%（w/v）β-巯基乙醇酿制量：5ml酿制方法：
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