琼脂糖凝胶电泳实验
2011-11-03 09:43:56 来源：生物秀评论：
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实验二琼脂糖凝胶电泳实验【实验目的】（1）学习琼脂糖凝胶电泳的基本原理；（2）掌握使用水平式电泳仪的方法；（3）学习在含有甲醛的凝胶上进行RNA电泳的方法。

【实验原理】琼脂糖凝胶电泳是基因工程实验室中分离鉴定核酸的常规方法。

核酸是两性电解质，其等电点为pH2-2.5，在常规的…
【注意事项与提示】
（1）EB是强诱变剂并有中等毒性，易挥发，配制和使用时都应戴手套，并且不要把EB洒到桌面或地面上。

凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。

简单处理方法为：加入大量的水进行稀释（达到0.5mg/mL以下），然后加入0.2倍体积新鲜配制的5%次磷酸（由50%次磷酸配制而成）和0.12倍体积新鲜配制的0.5mol/L 的亚硝酸钠，混匀，放置1天后，加入过量的1mol/L碳酸氢钠。

如此处理后的EB的诱变活性可降至原来的1/200左右。

（2）由于EB会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使DNA迁移率降低。

因此，如果要准确地测定DNA的分子量，应该采用跑完电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色的方法。

（3）总RNA的分析：哺乳动物的RNA由28S rRNA、18S rRNA和mRNA以及其它小分子RNA组成，28S和18S rRNA处为明显的亮带（相当于4.5kb和1.9kb），28S/18S应为1.5-2.5/1；植物、昆虫、酵母和两栖动物的RNA带分布较小，约为0.5-3.0kb左右；假如28S/18S小于1/1，或者出现拖带，说明RNA已经有部分降解，如果28S和18S rRNA大部分已降解，则需重新制备。

【实验安排】
只需一天：上午配试剂倒胶，下午跑电泳并观察拍照。

【实验报告要求与思考题】
1、附上电泳结果的图片并进行正确的标注（如下图）
M：1Kb DNA ladder；1：质粒DNA
2、琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？
3、如果样品电泳后很久
都没有跑出点样孔，你认为有哪几方面的原因？
电泳流程图：
凝胶加样缓冲液
缓冲液类型6×缓冲液贮存温度
Ⅰ0.25%溴酚蓝
4℃0.25%二甲苯青FF
40%（W/V）蔗糖水溶液
Ⅱ0.25溴酚蓝
室温0.25%二甲苯青FF
15%聚蔗糖(Ficoll400)
Ⅲ0.25%溴酚蓝
4℃0.25%二甲苯青FF
30%甘油水溶液
Ⅳ0.25%溴酚蓝
4℃40%(W/V)蔗糖水溶液
碱性加样缓冲液:
使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三：增大样品密度；以确保DNA均匀进入样品孔内；使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利，含有在电块中能以可预知速率向阳极泳动的染料。

溴酚蓝在琼脂糖中移动的速率约为二甲苯青FF的2.2倍，而与琼脂糖浓度无关。

以0.5×TBF作电泳液时，溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速率约与长300bp的双链线状DNA相同，而二甲苯青FF的泳动则与长4kb的双链线状DNA相同。

在琼脂糖浓度为0.5%～1.4%的范围内，这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并不显著。

选用哪一种加样染料纯属个人喜恶。

但是，对于碱性凝胶应当使用溴甲酚绿作为示踪染料，因为在碱性pH条件下其显色较溴酚更蓝为鲜明。