粗分离 透析除去分子较小的杂质
纯化 纯度鉴定
通过凝胶色谱法将分子量 较大的杂质蛋白质除去
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳
鉴定血红蛋白纯度
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1.洗涤红细胞
阅读思考：洗涤的目的是什么？
洗涤过程： 3g柠檬酸钠
吸出血浆
5倍体积生理盐水
血液 100mL
低速离心 2 min
血浆 红细胞
红细胞
搅拌10min
重复洗涤3次，直至上清液没有黄色
2)原理
分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子大 小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速 度，从而实现样琼品脂中糖各凝种胶分电子泳的示分意离图。
3)类型: •琼脂糖凝胶电泳
•聚丙稀酰胺凝胶电泳
4)实例：SDS——聚丙稀酰胺凝胶电泳
原理： SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复 合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋 白质分子原有电荷量。使电泳迁移率完全 取决于分子的大小。 用途: 测定蛋白质的分子量
血红蛋白含有四条肽链,每条肽链环绕一个亚铁 血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧 化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。
鸡的红细胞 人的红细胞
鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA， 便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞 核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提 取血红蛋白
一.基础知识
(一)蛋白质分离和提取的原理
3）凝胶色谱法的原理—分子筛效应
大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快； 小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。
4）分离过程
混合物 洗 大分子流动快 上 柱 脱 小分子流动慢
收集 大分子
收集 小分子
洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白 质分子的差速流动。
2.电泳
1)概念 带电粒子在电场作用下发生迁移的过程
1.作用
抵制外界的酸或碱对溶液pH值的影响， 维持pH基本不变
2.配制
通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配 制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以 制得在不同PH范围内使用的缓冲液。
3.提问：在本课题中使用的缓冲液是
磷酸缓冲液
二.实验操作
样品处理
(1)红细胞的洗涤 (2)血红蛋白的释放 (3)分离血红蛋白溶液
3.分离血红蛋白
红细胞破 碎混合液
高速离心 10min
用滤纸过滤，除去脂溶 性沉淀层，于分液漏斗 中静置片刻后，分出下 层的红色透明液体。
（无色透明） （白色薄层固体） （红色透明液体）
（暗红色）
粗分离——透析
①过程
②透析目的
1mL 20mmol/L磷酸缓冲液
除去样品中分子量较小的杂质
纯化——凝胶色谱法
根据蛋白质各种特性的差异： •分子的形状、大小 •电荷性质和多少 •溶解度 •吸附性质 •对其他分子亲和力
（二）蛋白质提取和分离的方法 •凝胶色谱法：又称分配色谱法 •电泳法
1.凝胶色谱法 (分配色谱法)
1）概念
根据相对分子质量的大小分离蛋白质的 有效方法
2）材料：凝胶
凝胶是微小的多孔性球体，多糖类化 合物如葡聚糖或琼脂糖。内部有许多贯 穿的通道。
1.凝胶色谱柱的制作 2.凝胶色谱柱的装填 3.样品的加入和洗脱
注意事项
1. 红细胞的洗涤： 洗涤次数不能过少；低速、短时离心。 为什么？
2. 凝胶的预处理： 沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡
3. 色谱柱的装填： 装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱 液不能断流。
4. 色谱柱成思考： 1. 释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入
了哪些物质？ 2.为了加速释放过程，采取了什么措施？
目的分析： 1. 蒸馏水的作用是____使__红__细__胞__大__量__吸__水__胀__裂________。 2. 加入甲苯的作用是___溶__解__红__细__胞__的__细__胞__膜_________。 3. 充分搅拌的目的是___加__速__红__细__胞__的__破__裂___________。
鉴定蛋白质的纯度
讨论：如何测定蛋白质的分子量？
使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋 白质的分子量时，可选用一组已知分子量的 标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的 标准蛋白的电泳区带位置，可以测定未知蛋 白质的分子量。
(三)缓冲溶液
说出人体血液中缓冲液?
如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4