月季组织培养技术研究摘要：以MS为基本培养基，附加不同浓度的细胞分裂素（6-BA）和生长素(NAA)，以及用不同外植体部位筛选出最适合月季腋芽萌发的培养基和最佳外植体部位。
实验结果表明：诱导侧芽萌发以MS+6-BA2.0mg/L培养基效果最好，外植体部位以中部枝条发芽率最佳,为80%。
关键词：月季；组织培养；快速繁殖Abstract: Use MS as basic medium ,with different concentration of cytokinin and auxin,and use different part of the stem as explant for tissue culture to select the suitable mediumand best explants site for the induction of Rosa chinensis. The results showed that MS +6BA2.0mg / L is the suitable medium for bud germination, and the middle part of the stem isthe best explant.Keywords: Rosa chinensis, tissue culture, rapid propagation月季（Rosa chinensis）是蔷薇科落叶或半长绿灌木，其花色艳丽、香味浓郁，是世界栽培种类较多的多年生木本花卉之一。
由于其分布极广、适应性良好、栽培容易等优点，加之月季四季常青、花期长、花色多等特点，使得在园林和路带绿化以及庭院居室的盆栽美化和切花等方面都得到广泛的应用。
月季在观赏植物中具有很高的地位。
月季花型大、美丽、幽雅、高贵，深爱各国人民喜爱，月季的销售额多年来稳居各类花木的前茅。
被誉为“花中皇后”之美称，深受人们喜爱。
月季通常采用扦插和嫁接繁殖，一些名贵品种扦插不易生根，主要是靠芽接繁殖[1]。
而芽接速度慢，因而造成优良品种苗木供不应求。
应用组织培养技术可以大大缩短其增殖周期，达到快速繁殖优良品种的目的。
近年来随着生物技术的不断发展与更新，用植物组织培养的方法快速繁殖各种花木技术得到了普遍重视和广泛应用，关于月季的离体培养、根诱导及移栽问题，以有了不少报道[1、2、8、9、10]。
由于受基因影响，不同品种之间的组织培养特性表现出一定的差异[2]。
因此讨论不同品种组培快繁的培养条件，特别是培养基中适宜的不同激素配比仍具有重要价值，另外选择适合接种的外植体不同部位也会影响其发芽率。
本实验以月月红月季品种为材料进行了侧芽的诱导和筛选出适合月季组织培养最佳外植体部位的组织培养特性研究，试图找出适合月季品种的组培快繁的最佳激素配比的培养基和最适合培养的外植体部位。
1 材料与方法1.1 实验材料及采样地生境条件1.1.1 实验材料供试材料取自都江堰市中国科学院华西亚高山植物园月月红月季当年生无花蕾嫩茎。
1.1.2 采样地生境条件采样地位于成都平原与川西北山地之间，地理坐标：东经103°，北纬31°，海拔700 m左右，为浅切割低山地貌类型。
土壤为黄壤，质地为重壤质，PH值4.5～5.5，由于多雨，在沉积层与母质层之间有明显潜育现象，土壤肥力中等，保肥保水性好。
采样地属于亚热带气候类型，年平均气温15.2 ℃，极端最高、最底温度分别为38 ℃和～-10 ℃，年平均相对湿度81%，年平均降雨量1243 mm，无霜期269 d。
1.2 技术路线培养基的配制→培养基灭菌→外植体采集→外植体预处理→外植体表面灭菌→外植体接种→培养→试验结果统计与分析1.3 实验仪器与试剂仪器用品：高压灭菌锅、超净工作台、试管、电子天平、烧杯、微波炉、酒精灯、镊子试剂：75%酒精、琼脂、蔗糖、蒸馏水、6-BA、MS储备液、NAA1.4 培养基配方表1 培养基中6-BA和NAA的组成及配比处理号 6-BA NAA(mg/L) (mg/L)A1 2.0 ---A2 2.5 ---A3 2.0 0.1A4 2.0 0.51.5 培养基的配置称琼脂7.5 g→蒸溜水400～500mL →微波加热5 min →蔗糖30 g →微波加热5 min →大量元素母液→微量元素母液→有机物母液→铁盐母液→定容至1L →调pH至5.8～6.0 →分装→高温灭菌1.6 外植体采集与灭菌1.6.1 外植体采集在晴朗的清晨采集生长健壮，无病虫害母株上的当年生枝条。
1.6.2 外植体灭菌与接种采集回的外植体剪去顶部和基部并去叶，用洗衣粉水溶液轻轻洗涤30 min，自来水冲洗30 min后，用滤纸吸干，剪成约2 cm长带侧芽茎段。
在超净工作台上用70％的酒精消毒30 s，无菌水洗3次，再用0．1%升汞溶液消毒10 min，然后用无菌水冲洗5次，在无菌滤纸吸干后，将灭菌好的外植体接种于培养基上。
1.7 培养培养条件：培养温度25±1℃；光照强度1 800～2 000 1x；光照时间12 h／d。
1.8 数据统计培养30 d后统计外植体的污染率、发芽率。
污染率（%）=污染的外植体数/接种外植体总数×100发芽率（%）=发生芽的外植体数/无菌外植体总数×1002 结果与分析培养30 d后对6-BA、NAA浓度组合外植体的发芽率、污染率以及不同外植体部位的发芽率、污染率进行统计。
结果见表2、表3：表2 不同6-BA、NAA浓度组合外植体的发芽率、污染率处理号接种数(瓶) 培养基发芽率(%) 污染率(%)B1 20 MS+6-BA2.0mg/L 85 40B2 20 MS+6-BA2.5mg/L 30 20B3 20 MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L 65 40B4 20 MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L 40 352.1 6-BA浓度对外植体生长的影响从表2可见，处理号B1、B2中随着6-BA的浓度变化，相应的发芽率与污染率也随之发生了变化。
6-BA的浓度为2.0mg/L时发芽率为85%；6-BA浓度为2.5mg/L时发芽率为30%，。
这说明随着6-BA浓度的增高其发芽率下降，因为植物激素对外植体的生理作用与其使用浓度密切相关，浓度过高或过低都不能有效的诱导芽的萌发。
2.0mg/L是6-BA诱导月季芽萌发的适宜浓度。
2.2 6-BA与NAA组合对外植体生长的影响从表2中可见，处理号B3、B4中6-BA与NAA组合随着NAA浓度的增加其发芽率也随着增高， 6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L时，发芽率为65%；当6-BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L时，其发芽率为40%。
这说明给培养基中加入适量的NAA对外植体的萌发、生长有一定的促进作用。
因为外植体腋芽的萌发并不只是要求较高的细胞分裂素，而是要求在体内建立一个适宜的细胞分裂素与生长素的平衡[5]。
所以培养基要求有一定的细胞分裂素与生长素的配比。
从表2可以看出，6-BA2.0mg/L时的发芽率为85%，6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L时的发芽率为65%。
因此单独使用6-BA的发芽率效果比6-BA与NAA组合的培养基效果要好得多，说明了生长素浓度较高时抑制了细胞分裂，从而降低了形成芽细胞的生理活性，使某些芽的萌发受到了明显的抑制[4、6 ]。
实验得出最适合月季诱导侧芽萌发的培养基为：MS+6-BA2.0mg/L。
表3 不同部位外植体的发芽率、污染率外植体部位接种数发芽率污染率(个) (%) (%)茎段上部 10 40 50茎段中部 10 80 50茎段基部 10 50 602.3 不同外植体部位对发芽率的影响从表3可见，中部茎段外植体发芽率最好，为80%；这有可能是枝条中部较之上部和基部，营养状况好，营养物质积累丰富，外植体的生活力强，萌发力强，所以其发芽率就很高。
而上部枝条由于枝条幼嫩，营养物质积累有限，且本身的失水快，所以其萌芽率就会下降。
茎段下部由于木质化程度较高，所以发芽率比较低。
2.4 月季组织培养中的污染从实验结果可以看出，外植体平均污染率为42.2%。
本次试验中造成污染率过高的原因很多，（1）操作员出入多，造成接种室环境杂菌含量过高；（2）接种时，接种工具灭菌不彻底，操作没有严格按照要求进行；（3）接种人员操作熟练程度不够；（4）外植体消毒处理不完善等等。
3 结论（1）以月月红月季为品种，诱导侧芽萌发最适培养基为：MS+6-BA2.0mg/L。
发芽率为85%。
在培养基中加入一定量的NAA时，发芽率明显下降。
（2）以月月红月季为品种，实验筛选出最适外植体部位为：茎段中部，发芽率为80%。
4 讨论4.1 最适6-BA浓度的进一步筛选实验结果表明，诱导侧芽萌发的最佳培养基为：MS+6-BA2.0mg/L。
当6-BA的浓度增加到2.5mg/L时，外植体发芽率明显下降，因此6-BA浓度不可继续增加；如果将6-BA的浓度降低到2.0mg/L以下，较低的6-BA浓度对外植体的发芽率的影响有待进一步研究。
4.2 NAA的浓度对芽萌发的影响作用从实验中可看出，6-BA与NAA组合的培养基是随着NAA浓度的升高，发芽率也随着增高。
当培养基为：MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L，发芽率为65%。
培养基为：MS+6-BA2.0m g/L+NAA0.1mg/L，发芽率为40%。
进一步试验中可将NAA浓度继续升高，以确定NAA的浓度对芽萌发会有影响。
生长素的作用主要是促进细胞伸长和细胞分裂，诱导受伤的组织表面至数层细胞恢复分裂能力，形成愈伤组织，促进生根等，因此过高或过低的生长素都会抑制芽的萌发。
在培养基配制中适量的生长素浓度对芽的萌发有促进作用[3]。
4.3 月季组织培养中污染的控制针对此次月季组织培养实验污染率较高的问题，为完善月季组织培养技术，对常见的污染采取一些必要的控制措施。
(1)经常对接种室进行空间消毒；(2)对超净工作台仔细灭菌；(3) 工具用后及时灭菌，避免交叉污染； (4) 进一步筛选外植体材料灭菌的适宜方法；（5）接种人员加强培训，提高操作的熟练程度和规范程度；（6）培养过程中及时去除污染瓶。
一旦发现培养瓶内有污染产生，应立即采取合适的方法进行处理，如用高压蒸气灭菌。
本试验只是对月月红这一品种进行的研究，总体上看与他人关于月季的组织培养研究在某些结果方面具有一致性，但也有一定的差异[7]，这可能与其基因型差异有关，还需进一步研究。
因此在进行其它品种月季组培快繁时，进行培养基及各种激素的适宜浓度配比的探讨和筛选最佳外植体是必要的，不能盲目套用。
对实验中出现新问题进行更深入的科学研究，对完善月季组织培养技术有着重要的科学意义。