肿瘤微转移的机制与检测王宪灵,陈　兴(白求恩国际和平医院,河北石家庄050082) [关键词]肿瘤;微转移;机制;检测 [中图分类号]R73237　[文献标识码]B　[文章编号]167125098(2007)0320387203The M echan is m s and D etecti on of Tum our M i crom et a st a sisWANG Xian2ling,CHE N Xing(B ethune International Peace Hospital,Shijiazhuang,Hebei050082,China) Key words:Tu mor;M icr ometastasis;M echanis m s;Detecti on 转移是恶性肿瘤的生物学特性之一,也是影响肿瘤患者预后的重要因素。

近几年,肿瘤转移的研究已发展到细胞及分子水平,肿瘤微转移的概念也已逐步建立。

准确判断有无肿瘤转移以及转移的范围,可大大提高肿瘤治疗的有效率,改善患者的预后。

然而,临床及常规病理检查很难发现微转移的肿瘤细胞,只有通过免疫组化或PCR等特殊检查才能确定。

本文就肿瘤微转移的机制及检测途径作一简要综述。

1　微转移的概念自1869年首次报道并证实外周血中发现瘤细胞以来,微转移的研究逐渐成为肿瘤研究的一个热点。

微转移(m icr o2 metastases)是指在各种机体组织、体液及细胞移植物中检测到的镜下及亚显微水平的肿瘤残留,是用常规临床病理学方法不能检出的、隐匿在原发灶以外组织的、非血液系统恶性肿瘤的转移[1]。

1993年国际抗癌联盟(U I CC)出版的《肿瘤T NM分期补充材料》中指出,当远处转移灶生长至直径1mm ～2mm时,称作微转移。

2　肿瘤微转移的机制关于肿瘤转移存在两种学说,一是“种子与土壤假说”:认为是否形成肿瘤转移要看被转移部位组织的环境是否适宜原发瘤细胞的停留和生长。

这种学说认为,人体大部分转移瘤细胞由于受到免疫机制的杀伤或者转移瘤细胞局部环境不适宜而不能存活;只有少数细胞具有活力,在转移部位组织生长繁殖,形成转移瘤[2]。

二是肿瘤异质性理论:该理论认为由于瘤细胞遗传性状的不稳定,由单克隆起源的瘤细胞在不断增殖的过程中会发生异质性,导致瘤细胞的转移潜能有高低之分[3]。

恶性肿瘤的侵袭和转移是一个复杂的过程,其转移主要有3种途径:经血道转移、经淋巴道转移、直接侵及周围组织器官和播散至体腔。

肿瘤淋巴管、细胞因子的作用以及微环境的影响对原发瘤播散至远处组织器官起了很大的作用。

2.1　肿瘤淋巴管生成　由于毛细淋巴管无完整的基底膜,管壁薄,内皮细胞间有短暂裂隙,通透性高,有利于瘤细胞的进入,故在早期肿瘤转移以淋巴道为主。

淋巴管不仅参与肿瘤锚定生长所必需的基质成分的形成,而且当肿瘤实体长到1 mm～2mm时,肿瘤血管生成的过程也需要淋巴管参与。

肿瘤缺氧坏死也与缺乏完善的淋巴管系统有密切关系,前哨淋巴结的活检已被应用于一些恶性肿瘤(如乳腺癌和黑色素瘤)的诊断和分期。

近期有学者认为,肿瘤新生淋巴管是淋巴道转移的主要原因,且在淋巴管生成中淋巴管生成因子VEGF2C和VEGF2D起着关键作用。

在人的某些自发性癌转移模型和一些动物实验中证明VEGF2C和VEGF2D有促进肿瘤新生淋巴管形成的能力[4]。

随着对VEGF2C和VEGF2D研究的逐步深入,有学者[5]认为VEGF2D的表达在某些肿瘤中与新生淋巴管的形成成负相关。

目前,在实体瘤中淋巴管的存在与肿瘤淋巴道转移的关系上仍然存在较大分歧,Leu 等[6]认为肿瘤中缺乏功能性淋巴管,而McCarter等[7]则认为,淋巴管的生成是一个成功的肿瘤淋巴道转移实验模型的枢纽。

2.2　细胞因子的作用　恶性细胞间的相互粘着力较正常细胞间低,肿瘤细胞从原发部位脱落,侵入细胞外基质与基底膜中大分子蛋白粘附,启动细胞合成并分泌各种降解酶类,降解基底膜(B M)及细胞外基质(EC M),穿过脉管壁进入循环系统,在循环中逃避免疫系统攻击,最后穿过脉管,外渗达继发部位形成克隆,增殖形成转移灶。

癌细胞在转移过程中,需2次侵袭周围组织,2次穿越血管和淋巴管基底膜。

在此过程中有多种因子参与:运动因子如分裂素能刺激细胞的迁移、趋化、吞噬等;细胞粘附因子(Cell Adhesi on Molecules,CAM S)如整合蛋白、钙粘蛋白、免疫球蛋白超家族及选择素是介导细胞和细胞,细胞和细胞外基质粘附和相互作用的转膜糖蛋白,参与肿瘤的侵袭与转移;肿瘤细胞产生的胞外基质降解酶如组织蛋白酶、金属蛋白酶等可降解基质使肿瘤细胞易于迁移;归巢因子中的寻址素和归巢受体是一组能帮助肿瘤细胞找寻转移靶器官的因子,位于癌细胞的归巢受体与位于内皮细胞的寻址素共同作用,使癌细胞离开血循环到达特定的器官;新近又发现一类诱导细胞移动的趋化因子(Che mokines),可直接调控肿瘤细胞的转化和生长,调节肿瘤血管生成,促进肿瘤细胞定向移动,导致肿瘤细胞向远处转移。

2.3　微环境的影响　微环境因素以及肿瘤和宿主细胞间生物链对决定微转移灶的生存和生长可能具有关键的作用。

一定的微环境对于一些肿瘤的繁殖可能是有利的,但对于其他肿瘤则是不利的,具有明显的器官倾向性。

同时有动物实验证明,将不同的瘤细胞经静脉接种于大鼠体内,其转移灶的发生部位不同,实验的结果表明不同的瘤细胞在不同脏器内转移的分布上有明显的不同,对于每一种肿瘤都是高度特异的[8]。

瘤细胞转移的器官特异性是由于转移的瘤细胞高表达靶器官内皮细胞产生的粘附分子的配体,肿瘤细胞与靶器官内皮细胞特异性粘附以及靶器官内生长因子对肿瘤细胞生长的影响,是构成器官特异性转移的主要机制[9]。

各种肿瘤和宿主微环境之间关系不会完全一样,因而在器官特异性转移过程中,在不同器官中起主要作用的瘤细胞或宿主靶器官作用的特殊性也有所不同。

3　肿瘤微转移的检测目前,在临床上,许多恶性肿瘤的原发瘤和转移灶虽然经手术根治切除,甚至常规病理学检查为转移阴性的患者,部分仍死于肿瘤的复发和转移。

这可能与已存在的血循环、骨髓、淋巴道和不同组织器官的肿瘤微转移有关,因此,肿瘤微转移的检测具有重要意义。

选择合适的方法及肿瘤标志物,可明显提高微转移的检出率。

3.1　常规连续切片HE染色法　连续切片法一般用于淋巴结的微转移检测,其检出率与切片间距有很大关系,连续切片的细致分析,可从常规单张切片检查阴性的淋巴结中检出10%左右的微转移[10],而连续切片法一个标本需切几十至几百张切片,工作量大,临床难以推广,且对未形成转移灶的少量癌细胞难以检出,故近年来已很少使用。

3.2　免疫组化法　肿瘤细胞均具有各自特异的细胞标志物,免疫组化法就是选用针对肿瘤细胞特异标志物的抗体,用显色剂标记,在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的成色反应,对组织切片、细胞涂片进行染色,以寻找组织、血液、淋巴结、骨髓中的肿瘤细胞,以达到微转移检测的目的,并且可直接观察微转移细胞的形态。

由于操作较简便,成本相对较低,敏感性和特异性较高,该技术较早应用于临床。

该方法的不足之处在于费时,费用较昂贵,且因单抗之间存在交叉反应,肿瘤细胞表面抗原表达分布的不均质性、存在实际阳性染色结果判断操作的标准化问题,易出现假阳性、假阴性结果。

特异性抗体也可用荧光标记,采用附计算机装置的荧光显微镜对免疫荧光标记细胞进行扫描,可消除内源性碱性磷酸酶的影响,确定肿瘤细胞的绝对数目,微转移肿瘤细胞具有特异性免疫荧光可存盘,进一步作形态学、免疫学以及分子和细胞遗传学分析。

3.3　流式细胞术　流式细胞术(fl ow cyt ometry,FC M)的基本原理是用荧光标记的单抗与肿瘤细胞结合后,通过流式细胞仪即可检测到肿瘤细胞,其最大优点是可以对骨髓样品中的肿瘤细胞进行直接计数,并且能够将这些细胞分离进行进一步研究[11]。

这一过程是完全自动化的,排除了主观因素的干扰。

孙玲等[12]利用FC M检测96例非小细胞肺癌患者骨髓微转移,并且以非癌患者和正常人为对照,以实验组样品细胞F I值大于对照组细胞表达荧光强度的上限值(±2S)判为阳性,结果经手术治疗的非小细胞肺癌患者术前骨髓微转移检出率为26%。

该方法虽然能进行细胞定量计数,但不能提供细胞形态学依据,同时由于仪器昂贵,非普通实验室所能承受,限制了该技术的推广。

3.4　聚合酶链反应和逆转录聚合酶链反应(PCR和RT2PCR)　该技术的原理是通过在患者的血液、淋巴结、骨髓中扩增出肿瘤细胞标志性基因或靶RNA来证实肿瘤细胞的存在。

应用PCR技术可扩增存在于肿瘤细胞内的异常DNA,首先要明确原发灶内有无肿瘤细胞基因突变以及突变类型,若未测得突变则不能应用PCR技术对待测转移位点进行微转移检测。

RT2PCR技术是通过扩增肿瘤细胞特异的或组织特异的标志物基因信使RNA来检测肿瘤细胞的存在的。

RT2 PCR检测肿瘤基因标志物是目前认为最适于发现肿瘤早期转移的方法,其灵敏度可达10-7～10-8,尤其适用于微量样本中目的基因的获取或微量肿瘤细胞的检测。

用免疫组化等方法检测结果为阴性时,仍可用组织特异性标志物信使RNA 检测来表明肿瘤细胞的存在。

PCR技术用于检测基因的表达,所需样品少、省时、经济,但也有其不足,如不能确定是否存在活的肿瘤细胞,外源基因污染、假基因干扰、RNA的非法转录可致假阳性,而基因表达产物变异、取材的局限等可致假阴性。

同时,RT2PCR的灵敏度极大程度上取决于所扩增的对象(即靶RNA)的特异性,但目前绝大多数肿瘤细胞缺乏其特异性信使RNA,实验操作上也有待于进一步标化。

随着新的肿瘤特异性标志物的发现,PCR反应条件的优化,RT2 PCR有可能成为检测肿瘤微转移的常规方法。

3.5　免疫磁分离　新近建立的用于改进循环单个瘤细胞检测的方法,采用F I TC2结合抗2全细胞角蛋白2单克隆抗体阳性细胞,与超顺磁抗2F I TC微珠耦联,然后进入高梯度磁场与免疫磁性活化细胞筛选机。

富集的样本准备作FC M、免疫荧光术、免疫细胞化学或RT2PCR检测[13,14]。

Park等[15,16]应用磁珠包被的抗CE A单抗分离肿瘤患者外周血中瘤细胞,然后进行RT2PCR,并以常规RT2PCR作对照,结果免疫磁珠RT2 PCR和常规RT2PCR在1m l外周血中检出癌细胞的数量分别为101和102,因此认为免疫磁珠RT2PCR诊断微转移的敏感性和特异性优于常规RT2PCR。

免疫磁分离可提高微转移瘤细胞检测的敏感性,从而减少假阳性和假阴性。

肿瘤转移是一个多因素、多阶段、多步骤的复杂过程。

因此对肿瘤微转移的研究也是一项复杂的工程。

通过对肿瘤微转移机制的深入研究,可以寻找更科学、有效的肿瘤治疗方案,以提高临床治愈率,而微转移的检测无疑对建立个体化的治疗方案具有重要作用。