ISSN 100020054CN 1122223 N 清华大学学报(自然科学版)J T singhua U niv (Sci &Tech ),1999年第39卷第6期1999,V o l .39,N o .66 3520～22钝顶螺旋藻中藻蓝蛋白的分离纯化及特性研究3殷 钢, 刘 铮, 刘 飞, 李 琛, 丁富新, 袁乃驹清华大学化学工程系,北京100084 收稿日期:1998208206 第一作者:男,1973年生,博士研究生 3基金项目:国家“九五”科技攻关项目,962C 03204205文 摘 为发展新型海洋药物,采用Sephacryl S 2200凝胶层析和羟基磷灰石柱层析对人工养殖钝顶螺旋藻中的藻蓝蛋白进行了分离和纯化,得到了藻蓝蛋白纯品。
测定了藻蓝蛋白的氨基酸组成和含量。
藻蓝蛋白的紫外、可见吸收光谱表明其最大特征吸收波长为278,360,620nm 。
得到的藻蓝蛋白经等电聚焦显示为一条带,其等电点为pH =4.3。
还测量了藻蓝蛋白红外吸收光谱。
研究所获得的藻蓝蛋白为后续开展临床应用提供了可靠的样品。
关键词 钝顶螺旋藻;藻蓝蛋白;分离;纯化分类号 Q 51 螺旋藻是一种丝状多细胞螺旋形藻类生物,藻体由于含有藻蓝素而使外观呈蓝绿色。
现已发现的螺旋藻共有36个个种,多数为淡水种。
它含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素、矿物质、叶绿素、Β2胡萝卜素及多糖类物质,是人类理想的食物及药物资源[1]。
目前用于工厂化生产的主要是钝顶螺旋藻和极大螺旋藻。
螺旋藻作为新型药物资源成为当前海洋药物研究的焦点之一。
螺旋藻中含有丰富的藻胆蛋白,藻胆蛋白中又包含藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白以及藻红蛋白等蛋白。
藻蓝蛋白是螺旋藻中重要的捕光色素蛋白,它以近乎100%的高效率把光能优先地传递给光系统 [2]。
研究表明,藻蓝蛋白具有提高人体免疫力,促进动物血细胞再生,抑制某些癌细胞等作用[3]。
临床实验证明藻蓝蛋白—铜激光对大肠癌细胞株有很强的杀伤效应[4],同时藻蓝蛋白还是一种无毒、无副作用的理想光敏剂[5]。
大规模螺旋藻人工培育和繁殖在中国已取得成功,而螺旋藻药物的研制开发目前尚处于起步阶段。
对于螺旋藻中的各成分进行分离纯化,研究其化学结构、理化特性及其生理作用是螺旋藻药物研究中重要的前期工作。
本文以中国生产的钝顶螺旋藻为原料,对其中的藻蓝蛋白进行分离、纯化和特性研究。
1 实 验1.1 藻蓝蛋白粗品的制备选取产于中国海南省三亚市的人工养殖钝顶螺旋藻进行藻蓝蛋白的分离纯化。
螺旋藻干粉先进行细胞破碎,然后用水溶液抽取,所得产品冻干后得到蓝色粗晶体[6]。
1.2 藻蓝蛋白分离纯化分别采用凝胶过滤和羟基磷灰石柱层析进行藻蓝蛋白的分离纯化。
先利用凝胶把分子大小不同的物质分开。
所采用凝胶为Sep hacryl S 2200(Phar m a 2cia B i o tech ,瑞典),洗脱液采用磷酸缓冲体系。
利用羟基磷灰石表面的钙与核酸分子上磷酸基团的极性吸附可进行核酸的分离。
实验时首先采用羟基磷灰石吸附蛋白、核酸混合物,然后采用磷酸盐溶液进行梯度洗脱。
1.3 藻蓝蛋白分析与鉴定1)氨基酸组成分析样品按常规处理,用日立853250型氨基酸自动分析仪测定。
2)等电点测定采用瑞典Phar m acia B i o tech AB 制造的PhastSystem 电泳设备,所选择的pH 梯度为3～9,藻蓝蛋白的等电点从标准曲线上读取。
3)紫外可见和红外吸收光谱测定紫外可见吸收光谱采用H ew lett Packard 8452A 分光光度计测定,测定在室温下进行,扫描范围为200～800nm 。
红外吸收光谱则采用与KB r 压片,Sh i m adzu FT I R 28201PC 红外光谱仪测定。
2 结果与讨论2.1 藻蓝蛋白的分离与纯化1)凝胶层析藻蓝蛋白粗品用磷酸缓冲液溶解后经Sephacryl S 2200柱层析,层析柱规格为直径16mm ,长为100c m ,洗脱液选用0.02m o l L N a 2H PO 4+0.1m o l L KC l 缓冲液,流速0.8mL m in 。
实验所得的洗脱曲线如图1所示。
图1 藻蓝蛋白粗品凝胶层析洗脱曲线由图1可知经过凝胶过滤得到5个主要组分,蛋白主要集中于组分1和组分2,其中组分2呈深蓝色,可能含有目标组分藻蓝蛋白。
各组分在260和280nm 下的吸光度比值大多在1～2之间,具有核酸的特征。
2)羟基磷灰石柱层析将组分2浓缩、透析脱盐后用羟基磷灰石吸附,然后用不同浓度PO 3+42KC l 溶液来进行梯度洗脱,洗脱液中N a 2H PO 4的浓度分别为0.001,0.01,0.02,0.05,0.1和0.2m o l L ,KC l 浓度为0.1m o l L ,洗脱速度为0.52mL m in 。
实验所得洗脱曲线如图2所示,主要获得6个组分。
实验中分别测定上述6个组分的紫外可见吸收光谱,实验结果表明组分1为柱穿过组分;组分2分别在278,360,620nm 处有吸收峰,具有藻蓝蛋白的光谱特性;组分3组分蛋白含量较少,光谱特性不明显;组分4分别在278,350,650nm 处有最大吸收峰,具有别藻蓝蛋白的光谱特性;组分5,6都是与羟基磷灰石吸附较为强烈的蛋白、核酸混合物。
上述吸收光谱测定结果表明羟基磷灰石色谱分离所获的组分2为藻蓝蛋白,组分4为别藻蓝蛋白。
藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白的吸收光谱如图3所示。
图2 组分2经羟基磷灰石层析洗脱曲线图3 藻蓝蛋白(CPC )与别藻蓝蛋白(A PC )的紫外可见吸收光谱2.2 藻蓝蛋白的特性研究1)藻蓝蛋白的氨基酸组成分析由上述纯化过程所获得的藻蓝蛋白的氨基酸组成和质量分数,结果如表1所示。
表1 藻蓝蛋白的氨基酸组成和质量分数w 氨基酸100×w GLU 1315A SP 1218ALA 910L EU 910A R G 718I L E 615SER 611THR 519GL Y 519L YS514氨基酸100×w VAL 514T YR 411PH E 410H IS 115PRO 212A 2ABA 未检出CYS 未检出H YPRO 未检出M ET 未检测TR P未检测2)等电点测定测定藻蓝蛋白的等电点,如图4所示。
结果表明本实验获得的藻蓝蛋白为电泳纯。
藻蓝蛋白的等电点为pH 4.3。
12殷 钢,等: 钝顶螺旋藻中藻蓝蛋白的分离纯化及特性研究(am ylongluco sidase 3.50;soykan tryp sin inh ibito r 4.55;Β2lactoglobulin 5.20;A bovine carbonic anlydrase B 5.85;hum an carbonic anlydrase B 6.55;m yoglobin basic band 7.35;lectil lectin acidic band 8.15;lectil lectin m iddle band 8.45;lectil lectin basic band 8.65;(a )藻蓝蛋白 (b )标准pH 梯度蛋白图4 等电聚焦图谱 3)红外光谱测定藻蓝蛋白的红外光谱如图5所示。
图5 藻蓝蛋白的红外光谱藻蓝蛋白分别在3200,1650,1550,1100,1050,650c m -1处有吸收峰。
红外光谱为藻蓝蛋白的鉴定提供了更丰富的依据。
3 结 论采用Sep hacryl S 2200凝胶层析和羟基磷灰石色谱从人工养殖的钝顶螺旋藻中分离出藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白,其吸收光谱分别与文献报导一致,其中藻蓝蛋白等电点pH =4.3。
本研究所获的藻蓝蛋白为电泳纯,为后续开展有关螺旋藻蛋白理化特性和医用价值研究提供了可靠的样品。
参 考 文 献1C laudi o S .M ass p roducti on of S p iru lina .Experientia,1982,38:40～432Glazer A N.A m acromo lecu lar comp lex op ti m ized fo rligh t energy transfer .B i och i m B i ophys A cta,1984,768:29～513Schw artz J L ,Shk iar G .Grow th inh ibiti on anddestructi on of o ral cancer cells by extracts of S p iru lina .P roc Am er A cad O ral Patho l,1986,40:23～274M o rco s N C.Phycocyanin laser activati on cyto toxiceffect and up take in hum an athero sclero tic p laque .L asers Surg M ed,1988,8:7～105Glazer A N.Phycobili p ro tein s 2a fam ily of valuable,w idely used fluo ropho res .J A pp l Phyco l,1994,6:105～1156Siegel m an H W ,Kyeia J H.H andbook of Phyco logial M ethod .B ritain:Cam bridge U niversity P ress,1978Isola tion and character iza tion of c -phycocyan i n from Sp iru linap la tensisYI N G a ng ,L I U Zhe ng ,L I U Fe i ,L I C he n ,D I N G Fux in ,Y UAN Na ijuD epartm ent of Chem ical Engineering,T singhua U n iversity,Beijing 100084,Ch inaAbstract R esearch in to the separati on of phycocyanin s from S p iru lina is of great i m po rtance fo r the developm en t of novel m arine pharm aceu ticals .Iso lati on and purificati on of c 2phycocyanin from cu ltivated S p iru lina p la tensis w as accomp lished by Sephacryl S 2200gel filtrati on and ch rom atograhy on hydroxylapatite .A nalysis of am ino acids compo siti on of c 2phycocyanin w as conducted .T he c 2phycocyan in had m axi m a abso rp ti on at w avelength of 278,360and 620nm ,respectively .T he IEF show ed the h igh purity of the c 2phycocyanin recovered by the m ethod described .T he isoelectric po int of c 2phycocyanin is at pH =4.3.Infrared abso rp ti on spetra of c 2phycocyanin w as also m easu red .T he resu lts are of fundam ental i m po rtance fo r the com ing research focusing on clinical app licati ons of the S p iru lina p ro tein s .Key words S p iru lina p latensis ;c 2phycocyanin;iso lati on;purificati on22清华大学学报(自然科学版)1999,39(6)。