第25卷　第3期2008年6月 黑龙江大学自然科学学报JOURNAL OF NAT URAL SC I E NCE OF HE I L ONGJ I A NG UN I V ERSI TY Vol 125No 13June,2008枸杞多糖分离纯化及性质研究张　晶1,2,　韩喜江1,　李艳波2(1.哈尔滨工业大学化学系,哈尔滨150001;2.哈尔滨学院生化学院,哈尔滨150080)摘　要:对东北枸杞中提取的多糖,通过DEAE -cellul ose (OH -)色谱柱和Sephadex G -100凝胶色谱柱进行了分离纯化,通过凝胶色谱和液相色谱对其纯度进行了鉴定,并通过红外光谱初步分析了其基团构成。

关键词:枸杞多糖;分离纯化;纯度鉴定中图分类号:R28412,TS244文献标志码:A 文章编号:1001-7011(2008)03-0377-04收稿日期:2008-01-16作者简介:张　晶(1973-),女,实验师,硕士,主要研究方向:应用化学、食品化学0　引　言枸杞是一种食药两用植物,具有多种药理作用和生理功能。

枸杞多糖是枸杞中的主要活性成分之一,其中有关枸杞多糖的化学、药理与临床研究十分瞩目,已有不少研究报道枸杞多糖具有增强免疫力、抗癌、防衰老、抗疲劳、降血压、降血糖、抑制肿瘤生长和细胞突变等作用[1-2]。

鉴于枸杞多糖具有多种药理作用和生理功能,因此,对其提取分离方法及纯化的研究显得尤为重要[3]。

本文重点对牡丹江地区枸杞多糖的分离纯化及组成结构作了初步探讨。

1　实验材料和方法111　材料与仪器牡丹江地区枸杞子;其它试剂均为分析纯。

自动部分收集器,台式干燥箱,紫外分光光度计,Perkin -El 2mer 红外光谱仪,Aglilent 1100液相色谱仪等。

112　枸杞多糖提取称取100g 枸杞子60℃烘干,放置干燥器18h 后粉碎,称取10g 干燥的枸杞粉,用氯仿-甲醇(2∶1)300mL,用索氏回流装置于60℃回流脱脂。

残渣风干后,加入适量水,在100℃,料水比1∶15条件下水浴提取4h,抽滤,将滤液蒸发浓缩为原体积的1/4后,将浓缩液滴入3倍体积的95%乙醇中,静置,抽滤,固形物分别用95%乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤,水浴加热干燥得枸杞粗多糖[4]。

113　枸杞多糖分离纯化11311　DEAE -cellul ose (OH -)色谱柱层析将分离提取的枸杞粗多糖110g 溶于水,上DEAE -cellul ose (OH -)色谱柱,梯度洗脱法洗脱各级分,洗脱液分别为蒸馏水、011mo1・L -1,0125mol ・L -1和015mol ・L -1NaCl,011mol ・L -1Na OH 各100mL,流速为30滴每分钟,自动部分收集器收集洗脱液,将收集到的样品溶液分别在280nm 波长下比色,然后用硫酸一蒽酮法测定总糖含量。

以试管数目为横坐标,以吸光度为纵坐标作DE AE -cellul ose (OH -)色谱柱洗脱曲线图。

分别合并各主峰溶液,浓缩,流水透析,冷冻干燥,得LBP -1,LBP -2,LBP -3和LBP -4.11312　Sephadex G -100凝胶色谱柱。

收集多糖含量最多的组分,进行凝胶色谱分离。

流速为013mL ・m in -1,每支试管接收3mL 洗脱液,硫酸一蒽酮法检测多糖洗脱状况。

以洗脱管数为横坐标,吸光值为纵坐标作流出曲线,合并主峰溶液,浓缩,流水透析,冷冻干燥。

114　L BP 纯度鉴定多糖的纯度标准不能用通常化合物的纯度标准来衡量,多糖纯度判断可根据糖基的摩尔比是否恒定,电泳是否呈一条带,柱层析是否呈现一个峰来进行[5]。

11411　凝胶层析法称取2mg LBP 样品,溶于1mL 蒸馏水中,上Sephadex G -100凝胶色谱柱,重蒸水洗脱,流速为013mL ・m in -1,每支试管接收3mL 洗脱液,硫酸一蒽酮法检测多糖洗脱状况。

以洗脱管数为横坐标,吸光值为纵坐标作流出曲线。

11412　高效液相色谱法(HP LC )鉴定仪器∶Aglilent1100液相色谱仪;色谱柱∶双柱串联79911GF -083、79911GF -084色谱柱;监测器∶示差R I D 监测器;流动相∶蒸馏水;流速∶1mL ・m in -1;内部温度∶30℃;柱温∶25℃.115　L BP -4红外光谱测定[6-8]称取LBP 1～2mg,加入100mg K B r 充分研磨,压片,用红外光谱仪于4000～650c m -1波长范围内扫描。

116　L BP 部分理化性质的测定配制一定浓度的枸杞多糖溶液,分别进行硫酸-蒽酮、考马斯亮蓝染色反应、碘-碘化钾反应以及菲林试验,检测是否含有多糖、蛋白质、淀粉以及单糖[9-10]。

2　结果与分析211　D EAE -cellulose(O H -)色谱柱分级结果由图1,2,3,4可看出,试验中检测到枸杞多糖共有4种多糖组分。

分别用蒸馏水、011mo1・L -1的NaCl及0125mo1・L -1NaCl 洗脱出现一个峰,011mol ・L -1Na OH 洗脱出现2个峰,依次命名为LBP -1,LBP -2,LBP -3和LBP-4,其中LBP -4多糖含量较高,故将其合并收集,真空冻干,为下一步纯化备用。

・873・黑　龙　江　大　学　自　然　科　学　学　报 第25卷　212　L BP -4Sephadex G -100凝胶色谱柱分级结果由图5可以看出,LBP -4经Sephadex G -100凝胶色谱柱分级共收集2个组分,依次命名为LBP -I 和LBP -II,由于LBP -II 含量较少,所以本实验主要对LBP -I 的性质进行研究。

213　L BP -I 纯度鉴定结果由图6可见,LBP -I 经过Sephadex G -100凝胶色谱柱层析,流出曲线为单一峰,表明LBP -I 为分子量分布均一的枸杞多糖组分。

由图7高效液相图谱的峰面积计算显示,多糖的纯度大于80%以上,说明该组分是纯度较高的多糖。

214　L BP -I 红外光谱分析从图8红外光谱可推测:3800～3300c m -1处的宽峰是由O -H 伸缩振动和N -H 伸缩振动引起的;2000～1500c m -1吸收峰是由-COO 的C =O 及NH 2对称伸缩振动引起的;1240c m -1吸收峰是由-COOH的-OH 变角振动引起的,同时1110c m -1吸收峰是仲碳-OH 的O -H 变角振动引起的;1050c m -1和1020c m -1吸收峰是伯碳-OH 的O -H 变角振动引起的,780c m -1吸收峰表明β-D -吡喃葡萄糖环的存在。

因此,可以推断LBP 中含有-OH 、-COOH 、-NH 2或-NH -。

215　L BP -I 紫外光谱分析多糖组分LBP -I 的紫外光谱分析结果如图9所示,LBP -I 在260nm 处没有吸收峰,表明枸杞多糖不含核酸;在280n m 处未见吸收峰,表明枸杞多糖不含蛋白质。

216　L BP 部分理化性质分析硫酸-蒽酮反应呈阳性,考马斯亮蓝反应呈阴性,菲林试剂反应呈阴性,碘-碘化钾反应呈阴性,所以,各级分为不含蛋白质、淀粉和还原糖的酸性多糖。

・973・第3期张　晶等:枸杞多糖分离纯化及性质研究3　结　论多糖提取工艺以及分离、纯化方法决定了产品的纯度,另外枸杞子产地的不同也可能对研究结果有影响。

本试验经DEAE -纤维素柱分离纯化,检测到枸杞多糖共有4种多糖组分,LBP -1、LBP -2、LP B -3、LBP -4,其中LBP -4含量最多,经过Sephadex G -100凝胶色谱柱层析和液相色谱鉴定为分子量均一的多糖,但从组成上看它们存在着微观不均一性,这是多糖的一个特点。

LBP 的红外光谱推测,可能含-OH 、-COOH 、-NH 2-或-NH -基团。

通过理化性质分析,证明LBP 各级分为不含蛋白质、淀粉和还原糖的酸性多糖。

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