2.3多糖的沉淀
沉淀法是分离生物活性物质的传统方法，在生物活性 物质提取中常用于初步分离。
有机溶剂沉淀法
在提取液中加入与水互溶的有机溶剂，使系统介电常 数减小，多糖溶解度减小而发生沉淀。
常用的有机溶剂有乙醇、甲醇、丙酮等。
2.5脱蛋白
粗多糖中往往混杂着蛋白质、色素、低聚糖等杂质， 必须分别除去。
多糖
2.1材料的预处理
根据不同原料性质，对一些样品进行粉碎处理，含脂 高应先脱脂，含色素高需进行脱色，通常采用丙酮、 乙醚、乙醇进行预处理以达到脱脂或脱色的目的。 对于含有较多单糖和低聚糖的样品可用热的80%乙醇 处理。
2.2多糖的提取方法
多糖为非极性大分子化合物，大多采用不同温度的水、 稀碱溶液或氯化钠水溶液做提取溶剂。
2.5脱蛋白
盐酸法
取样品浓缩液，用2mol/L盐酸调节其pH至3，放置过 夜，在3000r/min条件下离心，弃去沉淀，即脱去蛋白 质。
2.5脱蛋白
脱蛋白效果的检测方法 1.除去蛋白质的样品用紫外分光光度计检验，观察在 280mm处是否有吸收，如果无吸收则表明蛋白质已经 除尽。 2.茚三酮反应检测，结果呈阴性表明蛋白基本除去。
多糖的表征
1. 无还原性。
2. 大多难溶于水，溶于水后形成胶体溶液。
3. 有旋光性，但没有变旋现象。 4. 无甜味。 5. 在酸或酶的作用下水解成单糖和寡糖。 6. 分子量在数万到数百万之间
1、多糖的基本概述
多糖广泛分布于自然界高等植物、微生物（细菌和真 菌）、地衣、海藻和动物体内。
1、多糖的基本概述
常用的络合剂有氯化铜、氢氧化钡和醋酸铅等。得到 的络合物沉淀经水充分洗涤后,用酸分解, 得到游离 的多糖。
多糖的纯化
盐析法
根据分子量不同的多糖在一定浓度的盐溶液中具有不 同溶解度的性质分离各种多糖。
在多糖中加入中性盐( 如NaCl、KCl、(NH4)2SO4 等) 至一定浓度, 则在该盐浓度时溶解度最小的多糖便沉 淀析出,然后上清液继续加盐至更高浓度,则另一多糖 又沉淀析出。
2.2多糖的提取方法 稀碱提取法
0.1-1M氢氧化钠（钾），如几丁质提取用5%氢氧化 钠去杂质。
碱提多糖时易发生美拉德反应，可通过前处理去除小 分子糖、避免pH值处在8-10范围、避免提取温度在 60-80℃。 通氮气或加入硼氢化钠（钾）
2.2多糖的提取方法
微波辅助提取法
利用不同极性的介质对微波 能的不同吸收程度，使基体 物质中的某些区域和萃取体 系中的某些组分被选择性加 热，从而使萃取物质从基体 或体系中分离出来，进入到 介电常数小，微波吸收能力 较差的萃取剂中。
2.6脱色
活性炭脱色
活性炭属于非极性吸附剂，有着较强的吸附能力，特 别适合于水溶性物质的分离。
活性炭脱色效果同活性炭类型、活性炭用量、脱色温 度及pH值等相关。
2.6脱色
弱碱性离子交换树脂
植物来源的多糖，常含有酚型化合物而颜色较 深，这类色素大多呈负性离子，不能用活性炭 吸收剂脱色，可用弱碱性树脂DEAE纤维素或 DuoliteA-7来吸附色素。
干燥
将已透析的多糖溶液依次用无水乙醇、丙酮、乙醚进 行洗涤，洗涤后的多糖60℃真空干燥或冷冻干燥得精 制多糖。
多糖的纯化
由于提取的精制多糖为含有多种组分的多糖混合物， 因此需要进一步纯化。用于大分子多糖及多糖类复合 物的分离纯化方法有分步沉淀法、金属络合物法、离 子交换法、柱层析法等。
多糖的纯化
2.6脱色
大孔吸附树脂柱层析
2.6脱色
氧化脱色
对于与糖结合型的色素，易被DEAE纤维素修复，不 能被水洗脱，可进行氧化脱色。
以浓氨水或NaOH液调至pH8.0左右，50℃以下滴加 H2O2至浅黄色，保温2小时。（氧化色素同时，造成 多糖的降解）
2.6脱色
脱色方法的选择
活性炭脱色：适用于大量制备性分离，同时吸附一定 的多糖，造成多糖的损失。 树脂脱色：适用于植物来源的多糖 发酵来源的多糖颜色一般较浅，色素含量较少，一般 可不除色素
多糖的分离纯化及结构表征
员工培训 2012-7-31
1、多糖的基本概述 多糖，又称多聚糖，是由10个以上的单糖通过 苷键连接而成的链状聚合物。 (C6H10O5)n， n>10
1、多糖的基本概述
组成分类
同多糖：由一种单糖组成（淀粉、半纤维素、几丁质等） 杂多糖：由两种或两种以上单糖组成（透明质酸、硫 酸软骨素、硫酸皮肤素等）
多糖的纯度鉴定
电泳法（Electrophoresis）
多糖在电场作用下，按其分子大小、形状和所带电荷 的不同而移动不同的距离。若为纯品，电泳后会得单 一斑点。 较常用，目前主要有醋酸纤维薄膜电泳、高压电泳法、 聚丙烯凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳、玻璃纤维纸电泳 等
多糖的纯度鉴定
比旋光度测定法
不同的多糖具有不同的比旋度，同时在不同的低级醇 中有不同的溶解度。在一定浓度的低级醇中，分子量 大的较分子量小的溶解度小。因此，不同浓度的低级 醇中得到的多糖沉淀的比旋度相同，则证明该多糖为 均一组分。 受溶液的温度、浓度特别是微量成分的改变而影响较 大。
愈来愈多的研究发现, 人的生命过程几乎都与糖链有 关:
细胞间通讯、识别和相互作用
细胞的运动和粘附
病原与宿主细胞的作用 糖链携带着生物信息. 它在细胞表面的分子识别过程 中起着决定性作用. 大量研究证明许多多糖具有免疫调节、降血糖、降血 脂、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗病毒和保护胃肠系 统等多种生物活性
2.3多糖提取液浓缩
超滤法 在一定压力下，小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的薄 膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而 使大分子物质得到部分的纯化。
2.3多糖提取液浓缩
透析法 把装有提取液的透析袋埋在吸水力强的聚乙二醇或甘 油中，提取液中水分通过透析袋到吸水剂中，从而达 到浓缩效果。
真空浓缩 通过真空泵抽真空，使水的沸点降低而 从提取液中蒸发出来，而多糖成分不受 破坏。
2.7除去小分子杂质 透析
利用溶液浓度扩散效应，将分 子量小的物质如无机盐、低聚 糖、氨基酸等从透析袋渗透到 袋外的蒸馏水中，不断换水即 可保持浓度差，从而除尽小分 子杂质。
2.7除去小分子杂质 超滤
以特殊的超滤膜为分离介质，以膜两侧的压力差为推 动力，将不同分子量的物质进行选择性分离。
2.8干燥
多糖的结构表征
组成单糖种类与数目不相同，多糖的结构非常复杂多糖 结构复杂，其研究主要包括以下内容： 1.相对分子质量 2.单糖的种类与物质的量比 3.各糖环的构象( 呋喃型或吡喃型)与异头碳构型
4.糖残基间的连接方式
5.二级结构及空间构象
多糖的结构表征
1.多糖相对分子质量测定 常用的方法有凝胶色谱法、蒸汽压渗透计法、端基法、 粘度法、光散射法、渗透压法和超滤法等。 凝胶色谱法是比较常用的方法，用已知分子量样品作标 准，建立标准曲线，求得待测多糖的相对分子质量。 多糖相对分子质量只代表相似链长的平均而不是确切的 分子大小。往往用不同的方法会得到不同的相对分子质 量。
多糖的分离纯化主要包括脱蛋白、脱色、脱盐和除去 小分子杂质
2.5脱蛋白
采用醇沉或其它溶剂沉淀所获得的多糖，常混有较多 的蛋白质，脱去蛋白质的方法有多种：如选择能使蛋 白质沉淀而不使多糖沉淀的酚、三氯甲烷、鞣质等试 剂来处理，但用酸性试剂宜短，温度宜低，以免多糖 降解。
2.5脱蛋白
沙维积法（Savage法）
多糖的纯化
柱层析法
柱层析方法是目前多糖中应用最多的方法, 原因是效 果好, 操作简单。主要包括：纤维素柱层析、阴离子 交换柱层析、凝胶柱层析、亲和层析法等。
多糖的纯化
多糖的纯化
多糖的纯化
季胺盐沉淀法
根据长链季胺盐能与酸性多糖或长链高分子量多糖形 成络合物, 在低离子强度的水溶液中不溶解的特性, 使 其沉淀析出, 然后增加溶液的离子强度到一定范围, 络 合物则逐渐离解, 最终溶解。
2.2多糖的提取方法
酶法
酶解反应较温和将组织分解，增加多糖的溶出，可较 大幅度提高产率。
常用于除去各种与多糖结合的结合蛋白质。
2.3多糖提取液浓缩
多糖提取液浓缩应尽量在低温下进行，并防止提取物 与氧气接触，防止多糖被氧化，保持原有结构及生物 活性。 吸附法
干葡聚糖凝胶加入提取液中，两者比例为1:5.由于凝 胶吸水，提取液的体积可缩小三倍左右，多糖回收率 达80%。
易挥发，需在低温条件下进行
2.5脱蛋白
三氯醋酸法
在多糖水溶液中滴加5％-30％三氯醋酸，直至溶液不 再继续混浊为止，在5-10℃放置过夜，离心除去沉淀 即得无蛋白质的多糖溶液。 反应较为剧烈，易引起糖降解
2.5脱蛋白
酶解法
在样品溶液中加入蛋白质水解酶，如胃蛋白酶、胰蛋 白酶、木瓜蛋白酶、链霉菌蛋白酶等，使样品中的蛋 白质降解，经透析后得到基本无蛋白和小分子的多糖。 通常将其与Savage法综合使用除蛋白质效果较好。
多糖的纯度鉴定
多糖纯度鉴定方法
超速离心法、电泳法、比旋光度法及凝胶色谱法。
多糖的纯度鉴定
超速离心法（Ultra-centrifugal method）
微粒在离心力场中的移动速度与微粒的密度、大小与 形状有关。分子密度、大小和形状的微粒在离心力场 作用下形成单一区带。 不能完全将溶液中相对分子质量不同的分子分开，使 用具有一定的局限性
2多糖的提取分离
多糖存在形式： 细胞壁外-胞外多糖 细胞壁内-胞内多糖（大多数多糖） 细胞壁多糖 动植物的细胞大多由脂质包围，用机械粉碎后还必须 脱脂（沙氏提取器，乙醇回流）。 对于含有较多单糖和低聚糖的样品可用热的80%乙醇 处理。
2多糖的提取分离
原料 前处理 提取 滤渣 过滤或离心
滤液
醇沉 沉淀 脱蛋白 脱色 透析 柱层析