微生物检验规范1.目的明确微生物检验方法和监控标准，规范微生物检验的各项操作，通过对原料、产品及生产线各要求环节进行微生物测试，从检测结果来判定原料、产品及生产线微检监控点的微生物情况是否符合公司和国家规定的标准，确保产品品质。

2.适用范围公司所有需要作微生物检验的原料、每批产品及微检监控点。

3.职责3.1 品保微生物检验员负责微生物检验实验器材和无菌室的准备工作。

3.2品保微生物检验员负责原料和生产线微检监控点的微检样品抽样、保存、登记和微生物检测工作。

3.3成品制程人员负责成品微检样品的抽样工作，品保微生物检验员负责成品微检样品的保存、登记和微生物检测工作。

3.4品保微生物检验员负责出具检测报告并作出符合性判定。

3.5品保科长负责微生物检测报告的审核。

4.作业程序4.1实验器材4.1.1 实验器材、培养基和试剂1．超净工作台2．恒温培养箱36±1℃3．低温培养箱25-28℃4．恒温水浴锅46±1℃5．电子/托盘天平（精确到0. 1g）6．高压蒸汽杀菌锅7．烘箱8．酒精灯9．记号笔10．打火机11．镊子12．药匙13. 生物滤膜14．培养皿9cm/6cm15. 锥形瓶300ml/500ml+硅橡胶塞16．试管17．小发酵管18．试管架19．接种环20．显微镜21．塑料篮子22．移液管1ml、5ml、10ml23. 膜过滤设备24. 医用不锈钢剪刀4.1.2培养基和试剂1．总菌数培养基平板计数琼脂培养基2．大肠菌群培养基结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）、煌绿乳糖胆盐（BGLB）3. 霉菌、酵母菌培养基虎红培养基4．氯化钠6．乙醇7．二氧化氯粉剂8. 过氧乙酸4.2 微生物检验的前准备4.2.1检验所需器具的灭菌4.2.1.1培养皿及移液管的干热灭菌洁净干燥的培养皿，倒放于专用培养皿铁筒内，洁净干燥的移液管，尖端朝下，置于移液管专用的铁筒内，把铁筒放在烘箱中，于120℃干热灭菌120分钟后，调至160-180℃干热灭菌120分钟后，关掉烘箱，自然冷却至60℃以下，方可打开烘箱门取出置无菌室冷却备用。

4.2.1.2锥形瓶及移液管的湿热灭菌洁净的锥形瓶，塞上硅橡胶塞并用牛皮纸包扎好瓶口，洁净的移液管，用牛皮纸包扎完善后，置于蒸汽灭菌锅中，于121℃湿热灭菌20分钟即可。

4.2.1.3镊子、接种环等的火焰灭菌接种环、镊子要在酒精灯上须灼烧过方可使用；稀释操作时试管口应在火焰上方；培养基容器口边在火焰上方。

4.2.1.4化学灭菌（75%酒精、100×10-6ClO2）无菌超净台，手部及不能加热灭菌的PE或塑胶制品，桌子等需用化学灭菌法；操作台、桌子、凳子、地面在使用完后均用100×10-6 ClO2擦洗灭菌。

4.2.2培养基及其缓冲稀释液的配制和湿热灭菌4.2.2.1 0.9%生理盐水的配制称取2.25g氯化钠，溶于250ml蒸馏水中，经湿热灭菌即可。

4.2.2.2 75%酒精的配制取375ml无水酒精，则需加水375/0.75-375=125ml4.2.2.3培养基的配制和灭菌条件灭菌完全后的培养基置于46±1℃的水浴锅中,待培养基的温度降至46±1℃方可用.4.2.2.4 湿热灭菌的步骤：（1）检查蒸压釜中有否足够的水。

（2）检查所有载有液体瓶子的螺旋盖（或塞）是否有松动。

（3）检查各待灭菌物品是否已用牛皮纸包裹完善。

（4）小心地关好杀菌釜的盖/门。

除非每个锁都已彻底锁紧，否则不得加压。

（5）检查排气道或排气阀是否打开。

（6）加热，使所有空气从排气道中随着蒸汽自动排出。

蒸汽要猛烈排放2-3min，以保证蒸压釜内冷空气全部排出。

关闭通风阀或排气阀。

（7）继续加热，至达到预定压力及温度。

设备和培养基将在121℃下维持20min，以进行灭菌。

所需压力要连续维持一定时间。

（8）所需加热时间一过，停止加热。

在排气阀不打开的情况下让压力自动下降到零。

否则不要打开蒸压釜。

当压力为零时，小心打开排气阀，待蒸气排尽后，打开蒸压釜盖，让它敞开几分钟以泄去多余的热蒸汽，并将釜内原载有的物品充分冷却。

（9）取出釜内原载有培养基或生理盐水的瓶子，将这些瓶子存放在无菌室的传递箱中待之冷却备用。

灭菌完成后的培养基，温度降至46±1℃方可使用。

所有灭菌完成后的物品，在使用前都必须保持包裹完善无破损的状态。

4.2.3无菌室及超净台的灭菌4.2.3.1每天实验前、后把无菌室地面及超净台打扫干净，每天用100×10-6ClO2消毒桌面、地面。

每月用2%过氧乙酸熏蒸。

4.2.3.2实验结束后打开紫外灯对无菌室空间和表面进行杀菌1小时。

4.2.3.3实验前，提前1小时打开超净台紫外灯及无菌室紫外灯。

关掉紫外灯后，打开无菌室和超净台通风装置，30分钟后，即可进行实验操作。

4.3.样品的抽样和判定标准4.3.1实验前应登记样品，给样品编号，记录检验时间、品项、规格、生产日期、批号、检测项目等，并根据样品数来配制培养基。

4.3.2样品的抽样和判定标准天然水的产品名，抽样量、检测项目、频率、方法、标准备注：按抽样频率，检验方法一半采用GB-4789，一半采用滤膜法。

4.3.3生产线微检监控点的样品的抽样和判定标准各监控点名，抽样量、检测项目、频率、方法、标准4.4微生物检测方法4.4.1滤膜法: 适用于进行滤膜法检测的各种微检样品。

4.4.1.1 仪器：冰箱：0～4℃；恒温培养箱：36±1℃/25-28℃；恒温水浴锅：46±1℃；电子天平：精确至0.1g；灭菌平皿:直径60mm或90mm；膜过滤设备；滤杯；0.45μm滤膜；超净工作台；真空泵；高压灭菌锅；灭菌的剪子、镊子、玻璃瓶及其它物品。

4.4.1.2试剂与培养基平板计数培养基、虎红培养基、煌绿乳糖胆盐培养基，0.9%生理盐水，121℃灭菌20min；结晶紫中性红胆盐琼脂煮沸灭菌2min；75%乙醇；100ppm二氧化氯。

4.4.1.3操作步骤:（1）将样品摇匀，取100ml倒入膜过滤装置中，打开抽滤泵，开始抽滤，抽干滤液后关上抽滤泵。

（2）将镊子在火焰上灭菌，膜用灭菌过的镊子取下，在火焰旁正面贴于预先制备的培养基平皿中，平板计数琼脂培养基用于培养菌落总数，虎红琼脂培养基用于培养霉菌和酵母菌，VRBA培养基用于培养大肠菌群，膜下避免出现气泡。

（3）培养a.菌落总数：倒置于36±1℃的恒温箱中，培养48h±2h。

菌落总数以实际菌数报告之，单位为cfu/100ml或cfu/ml。

b.霉菌和酵母菌：倒置于25-28℃恒温箱中，3d后开始观察，共培养观察5d。

菌落总数以实际菌数报告之，单位为cfu/100ml或cfu/ml。

c.大肠菌群①倒置于36±1℃的恒温箱中，培养18h-24h。

取出平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。

典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。

②从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，36±1℃培养24h~48h，观察产气情况。

凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。

③大肠菌群平板计数的报告：经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以①中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每100ml样品中大肠菌群数。

例：在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10/100ml=60cfu/100ml。

4.4.2国标法：适用于不能用滤膜法检测的各种微检样品以及规定用国标法检测的样品。

4.4.2.1菌落总数4.4.2.1.1设备与材料：冰箱：0～4℃；恒温培养箱：36±1℃；恒温水浴锅：46±1℃；电子天平：精确至0.1g；灭菌吸管；灭菌平皿：直径90mm或60mm；超净工作台；高压灭菌锅及其它物品。

4.4.2.1.2培养基与试剂：平板计数琼脂培养基，0.9%生理盐水，121℃灭菌20min；75%乙醇；100×10-6 ClO2溶液。

4.4.2.1.3操作步骤：（1）样品稀释及培养a.以无菌操作取样品。

b.取样品25（g）ml加入到225ml灭菌生理盐水中，经充分混匀制成1：10的样品匀液。

c.用1ml灭菌吸管吸取1:10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入盛有9ml灭菌生理盐水的试管内（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液液面），振摇试管，混合均匀，做成1:100的稀释液。

d.另取1ml灭菌吸管，按上述操作方法，制备10倍系列递增稀释样品匀液，如此每递增稀释一次，即换用1支1ml灭菌吸管。

e.根据食品卫生标准要求或对试样污染情况估计，选择2个-3个适宜稀释度（液体样品可包括原液），对于菌数较少的样品，采用原倍。

在进行10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1ml样品匀液加入两个无菌平皿内，同时分别取1ml稀释液加入无菌平皿中作空白对照。

及时将6-7ml或15-20ml冷却至46℃的培养基倾注入平皿。

采用原倍培养的，直接将培养基注入培养皿中作为空白。

f.待琼脂凝固后，翻转平板，置36℃±1℃恒温箱内培养48±2h。

(2)菌落计数可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器。

记录稀释倍数和相应的菌落数量。

菌落计数以菌落形成单位（CFU）表示。

a.选取菌落数在30-300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。

低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300的可记录为多不可计。

每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

b.其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。

c.当平板上出现菌藻间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。

(3) 菌落总数的计算方法a.若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克（或毫升）中菌落总数结果。

b.若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按下式计算：N=∑C/（n1+0.1n2）d式中：N——样品中菌落数；∑C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；n1——第一个适宜稀释度平板上的菌落数；n2——第二个适宜稀释度平板上的菌落数；d——稀释因子（第一稀释度）。

c.若所有稀释度的平板上菌落数均大于300，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。

d.若所有稀释度的平板菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。