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异性差，特别在应用多克隆抗血清时更易出现； （2）所用抗体浓度过高或染色过程中切片干燥导致
抗体与组织产生非特异性结合； （3）组织或细胞中有内源性过氧化物酶、碱性磷酸
酶及生物素等产生非特异性显色；
免疫组化操作经验和体会
• 操作中应注意以下问题：
1.石蜡切片和冰冻切片均可，但要注意防止脱片。 2.消除内源性过氧化酶和非特意性背景染色要充分。 3.PBS洗涤要充分。 4.要设阴性和阳性对照。 5.显色注意底物要适量、时间要严格控制。
• 5.复合型 在常规免疫组化标记中，同一
种抗原可以同时表达于胞膜和胞浆、胞 核和胞浆、微绒毛和胞浆，但很少发现 胞膜和胞核同时表达。值得注意的是组 织标本固定不及时造成抗原移位或乳腺 ER和PR修复不充分也可以发生胞核和胞 浆同时阳性。
三、阳性标记组织学特征
• 根据免疫组化阳性细胞的组织学特点，
五、非特异着色特征
• 以下情况可干扰免疫组化标记结果的观察和判断：
（1）抗体交叉反应： 是由于该抗原决定簇同时 存在于多种组织细胞，如GFAP可同时存在于星 形胶质细胞和唾液腺肌上皮。S-100蛋白则更为严 重，可表达于多种组织细胞。因此，应全面了解 和认识该抗体的功能和标记范围。故抗体交叉反 应只要应用得当仍有助于诊断。
• 近十年来，免疫组化技术发展很快，在现代医学
的基础和临床研究中发挥着重要的作用，对疾病， 尤其是对肿瘤的诊断、鉴别诊断及发病机理的研 究提供了强有力的手段，但随着免疫组化标记物 的增多和利用，原为特异的标记物并非绝对特异， 而且出现交叉反应和异常表达的情况日益增多。 故对免疫组化标记结果的意义不能绝对化，应在 光镜观察组织形态的基础上，合理使用免疫组化 技术，审慎判断其标记的意义。
免疫组织化学技术
西南医院病理学研究所 冯俊明
• 免疫组织化学（简称免疫组化）是组织化学的
一种，它是利用已知的特异性抗体或抗原能特 异性结合的特点，通过化学反应使标记于结合 后的特异性抗体上的显示剂，如酶、金属离子、 同位素等，显示一定的颜色，并借助显微镜观 察其颜色的变化，从而在抗原抗体结合部位确 定组织、细胞结构的化学成份或化学性质。
肿瘤细胞与间质细胞、细胞与间质均为黄 色，相互累及一片，色度无深浅之分。这 种标记组织片不能作为免疫组织标记结果 判断依据。
• 非特异性染色的原因常为组织标本固定不佳、抗
体质量问题或稀释度不合理及操作方法不规范等。 因此，免疫组化特异性染色定位非常重要，如前 所述，阳性颗粒应位于细胞胞膜、胞浆或胞核， 阳性细胞与阴性细胞相互交杂，阳性染色强度深 浅不一。如果缺乏细胞间的不均一性染色，即是 呈阳性染色，常提示为非特异性染色。另组织片 边缘反应和出血坏死灶周围阳性反应不能作为诊 断依据。
6.消除内源性生物素活性：预先以0.01%抗生物素 溶液作用切片20min。
7.ABC复合物应在临用前30min配置。 8.ABC试剂保存温度以4℃ 为佳，保存达数年仍可
获满意效果。 9.抗体保存：-20℃ 分装冻存，或于4℃ 常规使用，
切忌反复冻融。
免疫组化常遇问题
（一）均匀的背景染色 1.酶-底物反应时间过长。 2.在孵育中切片干燥。 3.一抗或二抗稀释度不够。 4.切片洗涤不充分。 5.封闭所用的正常血清不对。
• 7.菊团型 阳性肿瘤细胞排列呈菊团样结
构，部分阳性细胞围绕血管排列。此型 多见于分化较好的神经内分泌肿瘤和胶 质细胞瘤等，阳性颗粒定位在细胞浆。
四、阳性标记强度特征
• 细胞免疫组化标记的阳性强度根据显色
程度分为弱阳性、中度阳性和强阳性； 也可依据阳性细胞在细胞中所占比例大 致分为：弱阳性，阳性细胞≤25%；中阳 性，阳性细胞25%~50%；强阳性，阳性 细胞>50%。
免疫组化结果的判断原则及 对假阴性和假阳性的认识
• 一、 免疫组化结果的判断原则
免疫组化具有特异性强、敏感性高及定 位正确等优点，但随着免疫组化应用的普 及和深入，越来越多的问题也随之出现。 因此，掌握对免疫组化结果的判断原则是 很重要的。
• 1.必须设染色对照 每批染色都要以特异性的阳性
对照和阴性对照为基础，才能对染色结果做出正 确的判断。没有阳性对照，就不能做出真正阴性 结果的判断；同理，没有阴性对照，也就不能做 出真正阳性结果的判断。因而，没有对照的免疫 组化染色，即使做出了判断也是不可信的。
• 2.弥漫型 阳性细胞呈弥漫性分布，细胞间无连
接，也可以单个细胞散在分布。此型中细胞几 乎都高度表达某种抗原，如淋巴瘤（白细胞共 同抗原）、Hodgkin病（粒细胞相关抗原、Ki1）、胃肠未分化癌癌胚抗原（CEA）及上皮膜 抗原、尤文瘤中CD99等。
• 3.片块型 较常见。阳性细胞多为细胞浆表达，细
胞间界限较清晰，但相互融合呈片状或团块状结 构。此型可见于上皮源性肿瘤、某些向上皮分化 的间叶源性肿瘤、恶性黑色素瘤、中分化神经内 分泌瘤及核形细胞瘤（如癌肉瘤和神经纤维瘤、 平滑肌肉瘤）。
• 4.网状型 此型主要见于细胞密度较大的
大细胞肿瘤，标记物多为膜抗原。阳性 细胞膜与膜间相互紧靠，而胞核呈阴性 反应，免疫组化标记显示网状结构。
（九）非特意性色淀 1.底物-显色液使用前未经过滤。 2.抗体使用前未离心。 （十）阳性反应太弱 1.抗体或其它试剂活性下降。 2.显色反应时间过短。 3.某些抗体的稀释度或孵育时间不够。 4.当加抗体时切片上缓冲液过多。
（十一）切片镜下模糊或黑点沉着 1.脱水不彻底：进入二甲苯前加一步等量
石碳酸/二甲苯混合液。 2.温箱干燥替代脱水过程。
片液中。
（五）某些抗体不着色 1.需要消化而没有消化。 2.封闭内源酶时使抗体活性下降。 3.切片在裱片或干燥时过热。 4.抗体过度稀释，一抗浓度小于二抗。 5.抗体过期或频繁冻融.
（六）内源性酶活性： H2O2 -甲醇封闭不恰当。 （七）脱片 1.切片无粘附试剂。 2.切片不干净。 3.冰冻切片：组织在贴片前已经充分固定。 （八）核轮廓模糊 1.切片已干燥（特别是冰冻切片）。 2.苏木素染液欠佳。
• 2.抗原表达必须在特定部位 阳性表达必
须在细胞和组织特定的抗原部位才能视 为阳性，如LCA在细胞膜上、Keratin在 细胞浆内、S-100蛋白在胞浆和胞核内， EMA在细胞膜上。不在抗原所在部位的 阳性表达一概不能视为阳性。
3.阴性结果不能视为抗原不表达 即阴性 结果不能认为具有否定意义；阳性表达 有强弱、多少之分，哪怕是只是有少数 细胞阳性（但要在抗原所在部位）也要 视为阳性表达，不能认为个别细胞阳性 而不作阳性看待。
免疫组化阳性细胞或阳性颗粒可呈以下 类型排列：
• 1.局灶型 阳性细胞呈不规则小灶性分布。阳性细胞
可多可少，排列不规则，无固定排列形式，阳性染 色深浅不一。细胞角蛋白、上皮膜抗原在低分化鳞 状细胞癌、腺癌和癌肉瘤；肌动蛋白和结蛋白在低 分化横纹肌肉瘤；NSE、神经丝蛋白、突触素在恶 性神经内分泌肿瘤及低分化星形胶质细胞瘤中胶质 原纤维酸性蛋白（GFAP）和恶性黑色素瘤中S-100 蛋白等均可表现为局灶性阳性。
• （2）肿瘤细胞异常表达： 可选用多种标记去证
实或排除，鉴别其真正组织来源或向某一组织细 胞分化。
• （3）肿瘤细胞吞噬组织抗原：是由于某些恶性肿
瘤细胞摄入周围正常组织细胞成分，虽然后者也 存在某些抗原，但不属于瘤细胞固有成分，胞浆 内抗原定位较模糊，因此应该区别。
• （4）非特异性染色 是指抗原无明确定位，
（二）部分区域背景着色 1.切片部分区域干燥。 2.显色反应物在封片介质中是可溶的，造成弥散。 （三）部分区域不着色 1.脱蜡不完全。 2.切片部分区域干燥。
（四）各种孵育结果所有抗体均不着色 1.H2O2终浓度不够或存放过久失效。 2.稀释液中有错误的正常血清（如猪抗兔酶
标抗体稀释液中有正常兔血清）。 3.显色反应物溶于脱水的酒精、二甲苯或封
免疫组化标记的形态学特征
• 免疫组化标记具有形态学特点，若能熟
练掌握则有助于对免疫组化标记结果的 正色度特征
• 免疫组化标记时细胞阳性着色程度取决于抗原含量、分布密
度和标记方法及其敏感性。一般而言，抗原含量越多，分布 密度越高，标记方法越敏感，阳性结果显色则越强。根据阳 性标记的显色程度分为：淡黄色，提示为弱阳性；棕黄色， 为中等度阳性；棕黑色，示为强阳性。在结果判断中，后两 者较有意义，可作为判断依据。而前者除考虑标本处理和方 法学因素外，可能与细胞只有轻度异常表达，或某些细胞摄 取了周围组织抗原之故。
二、阳性标记细胞学特征
• 免疫组化标记中，阳性标记细胞学特征是反映
抗原在细胞中的定位和分布情况。在诊断中阳 性细胞以拟标记的细胞为前提，阳性表达必须 在细胞特定的抗原部位，若不在抗原所在部位 的阳性表达和非目标细胞即使阳性也不应作为 判断依据。根据抗原在细胞中分布和阳性颗粒 沉淀部位可分为以下5种类型：
固定的标本中因抗原漏出而致假阴性，因此应多用新鲜固 定之标本； （3）操作步骤不当，如反应时间不够或过久、洗脱不够或温 度过高； （4）组织或细胞中抗原的含量很低，所用的方法难以检测到， 如用直接法检测为阴性，但改用间接法时则为阳性。
2.假阳性结果的主要原因是： （1）所用的抗体与其它无关的抗原有交叉反应，特
• 5.腺管型 主要见于腺癌和具有腺癌样结
构的胚胎性肿瘤。上皮标记物多为胞浆 表达。胃肠低分化腺癌中有时HE很难鉴 别腺样结构，但用癌胚抗原、上皮膜抗 原或结肠癌相关抗原则容易显示出来。
• 6.腔缘型 阳性颗粒主要位于腺癌腔缘的
微绒毛处，沿腺管腔缘表面内衬一薄层 黄色颗粒，基底部多为阴性。结肠癌相 关抗原在胃肠腺癌、胆囊腺癌、乳腺癌 中常表现为这种类型；卵巢癌相关抗原 在卵巢浆液性腺癌亦是如此；肿瘤相关 粘液抗原在许多腺癌中也显示腔缘阳性。
• 3.胞浆型 阳性颗粒主要分布于细胞浆。大部分抗
原均属于此种类型，如细胞角蛋白、波形蛋白、结 蛋白、神经丝蛋白、肌红蛋白、α1-抗胰糜蛋白酶 及前列腺特异性抗原（PSA）等。依据抗原在胞浆 内分布形式，通常表现为弥漫性分布或局限性分布。 前者阳性颗粒弥漫而均匀地分布于整个细胞浆。局 限性是指阳性颗粒呈小斑点状或斑块状局限于细胞 浆中的某一部位、核周或细胞浆的一侧。