山东大学实验报告2018年5月21日________________________________________ _________________________姓名：丁志康系年级：2016级组别：周一下午科目：细胞生物学实验题目：动物细胞培养及死活细胞鉴别学号：201600140055一、目的要求1.学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。

2.了解并掌握进行动物细胞原代培养的实验方法。

3.了解动物细胞培养的原理及注意事项。

4.学习细胞生死状态鉴别的方法。

5.了解细胞生死状态鉴别的原理。

6.熟悉和掌握各种鉴别细胞生死状态方法的判定特征。

7.掌握细胞计数方法，计算细胞存活率二、实验原理1、细胞培养细胞培养技术指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术，也叫细胞克隆技术。

细胞培养技术可以由一个细胞经过一段时间的培养得到大批的简单的单细胞或极少分化的多细胞，通过细胞培养可以得到大量的细胞或细胞代谢产物。

细胞培养技术是生物技术中最核心、最基础的技术。

细胞培养具有其他生物技术无可比拟的优点：培养条件易改变和控制，便于单因子分析；便于人们直接对细胞内结构，细胞生长及发育等过程的观察。

在生物学的各个领域已被广泛应用。

但细胞培养也存在一定的局限性：细胞的培养是在脱离了机体的外界环境之中，与体内环境存在一定的差别，因此细胞培养过程中观察到的现象有时难以正确反映机体内的状况。

2、细胞死活鉴定细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。

活细胞和死亡细胞在生理机能和性质上主要存在以下差异：①细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。

基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶（PI）或溴化乙啶（EB）等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。

此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。

活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液接触时不产生质壁分离。

②代谢上的差异：活细胞中新陈代谢作用强，细胞内的酶具有较强的活性和还原能力。

基于此，发展处了以荧光素二乙酸酯（FDA）、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态的方法，上述酯化的荧光素亲脂性提高，容易被细胞吸收进入，活细胞内的酯酶具有较强的活性，可将酯化的荧光素分解而释放出能发荧光的荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞内，荧光显微镜下显示有明亮的绿色或黄绿色荧光；而死亡细胞内的酯酶因失去活性，不能分解酯化的荧光素，荧光显微镜下显示不发光。

另外，可用美蓝为染料鉴定酵母细胞的生死状态。

美蓝是一无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。

活细胞因具有较强的还原能力，能使亚甲蓝从蓝色的氧化型变成无色的还原型，故活的酵母细胞在用亚甲基蓝染色后显示无色；死亡酵母细胞或代谢缓慢的衰老酵母细胞，因无还原能力或还原能力极弱，使亚甲蓝仍处于氧化态，故呈现蓝色或淡蓝色。

3、细胞坏死与细胞凋亡细胞坏死长期以来被认为是因病理而产生的被动死亡，如物理性或化学性的损害因子及缺氧与营养不良等均导致细胞坏死。

坏死细胞的膜通透性增高，致使细胞肿胀，细胞器变形或肿大，早期核无明显形态学变化，最后细胞破裂。

细胞裂解要释放出内含物，并常引起炎症反应；在愈合过程中常伴随组织器官的纤维化，形成瘢痕。

细胞凋亡（apoptosis）指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。

细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。

4、血球计数板血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有两个竖沟槽分成三个平台。

中间的平台中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各刻有一小方格网，每个方格网共分九个大方格，中央的一大方格作为计数用，称为计数区。

计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个中方格（大方格用三线隔开），而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个中方格（中方格之间用双线分开），而每个中方格又分成16个小方格。

但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。

计数区边长为1mm，则计数区的面积为1mm2，每个小方格的面积为1/400mm2。

盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。

使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。

三、实验用品1、实验材料：活体小白鼠；2、实验仪器：超净工作台、二氧化碳培养箱、普通光学显微镜、倒置显微镜、水浴锅、离心机；3、实验器具：解剖剪、解剖镊、眼科剪、眼科镊、注射器、普通针头、L型针头、移液枪、洗瓶、载玻片、盖玻片；4、实验试剂：75%酒精、细胞培养液、PBS液。

四、实验步骤1、小鼠脾细胞培养1）取材取小白鼠一只，采用断头法处死：清水洗小鼠并浸于75%酒精中灭菌3分钟。

取出转入超净工作台内的解剖盘内，无菌操作打开腹腔。

取出脾脏，去除其周围的脂肪组织，镊起脾脏用PBS液自上而下冲洗1—2次。

转入无菌玻璃培养皿，待用。

2）分离脾细胞①用滴管先向上述无菌玻璃培养皿中滴入PBS液30滴，再用“L”型针头注射器在皿中吸取PBS液0.2ml，然后将其沿脾长轴方向注射入脾内（使脾脏膨胀以利于细胞散开）。

②用针尖在脾脏上扎眼，并用“L”针头轻刮脾脏表面挤出脾细胞，用滴管吸皿中的PBS液冲脾脏并吹散刮出的脾细胞，稍倾斜并静置1—2分钟。

③吸取上述静置后的脾细胞悬液上清部分放入Eppendorf发管，并使量至1ml，以3000r/分离1—2分钟。

3）培养脾细胞①超净工作台中取塑料培养皿一个，用移液枪（1000μl）加入细胞培养液2ml，并在皿盖上画上标记，待用。

②取上述离心后的Eppendorf管，在超净工作台内开盖弃去上清液，用移液枪（200μl）吸取塑料皿中的培养液400ml加入弃去上清液的Eppendorf管中，用枪头吹匀管底的脾细胞，然后吸取200ml脾细胞悬液接种于上述塑料培养皿中，混匀，然后放入37℃、5%二氧化碳培养箱中培养。

2、死活细胞鉴别及细胞计数1）试剂配制：用生理盐水配置0.4%台盼蓝染液，备用。

2）染色计数：取0.5ml细胞悬液放于干净的试管中，加1-2滴（约0.1ml）染液，混合2-5min，滴加少许染色后的细胞悬液于放有盖片的血球计数板的斜面上，使悬液自然充满计数板小室。

注意不要使小室内有气泡产生，否则要重新滴加。

在普通光镜10倍物镜下计数四个大格内的细胞数，压线者数上不数下，数左不数右。

3）根据染色结果计算活细胞率：依据死细胞染成蓝色、活细胞不着色的原则计数死细胞数和细胞总数，以如下公式计算细胞存活率：活细胞率细胞总数死细胞数细胞总数五、实验结果1、小鼠脾细胞培养结果①细胞大小较为均匀，但存在一定差距；②细胞形状接近圆形，但边缘不光滑；③细胞透明程度较差，有的细胞中隐约可看到深色颗粒物；④细胞边缘较为模糊，边界不清晰。

总结：根据这些现象可知，培养两周后的小鼠脾细胞存活状态不佳，培养皿中存在大量死细胞。

图1 小鼠脾细胞培养两周后状态2、死活细胞鉴别及细胞计数1）所培养小鼠脾细胞死活细胞计数结果：表1 死活细胞计数结果2）所培养小鼠脾细胞照片图2 中方格1（左上） 图3 中方格2（右上）图4 中方格3（左下） 图5 中方格4（右下）图6 中方格5（中央）3）活细胞率活细胞率细胞总数 死细胞数细胞总数 六、 注意事项1. 细胞培养对无菌操作的要求较高，操作过程中一定要注意保持环境的洁净，手再放入超净工作台中前一定要消毒液浸泡，添加液体时要在酒精灯旁进行，扎枪头时不可以用手碰枪头，器具在使用前需要按照类别分别灭菌。

2. 杀死小鼠后，要将小鼠的血从颈部伤口处放尽方可进入下一步。

3. 用“L”形针头刮取脾细胞时，应注意不要用力过大，防止脾脏碎裂，出现大量组织碎块，影响实验。

4. 细胞计数时细胞悬液要滴加在血球计数板中央平台边缘的斜坡上，滴加少许后让液体由毛细作用自然渗入血球计数板与盖玻片之间，且不能有气泡，也不能从两边溢出，不然需要重新滴片。

5.计数时若观察到细胞过密，不便计数，可以用生理盐水进行适当稀释；若观察到细胞过稀，可以直接计数大方格中的细胞数目。

6.若计数时发现细胞分布不均，不同方格内细胞数目差距较大，应重新滴片。

7.压线细胞秉持“数上不数下，数左不数右”的原则进行计数。

8.对于被染上了蓝色，但颜色不深的细胞也应当按照死细胞进行计数。

七、思考与讨论1.生存状态良好的培养细胞大小基本均匀一致，形状呈圆形，细胞边缘有清晰的细胞膜界线，胞质透明度高，胞质内无空泡。

本组实验中培养两周后的细胞大小有差异，形状为近圆形，边缘不清晰，细胞颜色较深，隐约可见深色颗粒状物质，说明细胞活力低，存活状态差，并伴有一定数量的死细胞。

2.观察到培养两周后的小鼠脾细胞生存状态较差，之后死活细胞计数时得到所培养小鼠脾细胞的活细胞率仅为24.3%，原因应当是培养时间过长且培养过程中没有更换培养基，导致大量细胞代谢废物累计，营养物质缺乏，导致后期细胞死亡率升高，活细胞率下降。