进展评述抗体酶及其应用杨玉社　胡增建　嵇汝运　陈凯先(中国科学院上海药物研究所200031)摘要　生物学家一项惊人的发现:人体防御体系的武装2抗体,也能象酶那样起作用,这些被称作抗体酶的研究成功将会引起21世纪生物技术的一场革命。

本文介绍抗体酶的结构、制备方法、催化特征、应用及其发展前景。

关键词　抗体酶　外酶　过渡态类似物　催化作用酶是自然界经过数百万年进化而发展出来的生物催化剂,它能在极其温和的条件下高效专一地催化某些化学反应。

所以对任何一个我们感兴趣的通常化学反应(如药物合成中的关键反应步骤)设计一种象酶那样的高效催化剂是科学家们梦寐以求的。

抗体酶研究成功[1,2]以来,科学家设计制造酶的梦想正在逐渐变成现实。

酶和抗体的本质差别在于酶是和反应过渡态(激发态分子)选择结合的催化物质而抗体是和基态分子选择结合的催化物质,它们识别底物的机理是相同的。

抗体的多样性赋予它几乎无限的识别能力。

如果能以激发态的分子为半抗原激发免疫系统产生抗体,那么这种抗体反过来可能催化经过此过渡态的化学反应。

但激发态的过渡态分子不可能作为抗原来产生抗体。

但对某一特定的酶催化的化学反应,人们可以合成一种稳定态的分子,它在带电性能,几何形状与反应过渡态分子结构类似,这种稳定态分子称为过渡态类似物。

用这种过渡态类似物作为半抗原,诱导产生抗体,这样产生的抗体又能识别反应过程中真正的过渡态,该抗体具有酶摧化反应的基本特征,可能成为一种具有酶活性的抗体。

自1986年抗体酶宣告成功一来,迄今为止抗体酶已成功地催化了所有六种酶促反应和数十种类型的常规反应。

这包括羧酸酯、碳酸酯、磷酯酯、肽键、烯醇醚和糖苷键的水解,酰胺的形成和水解,酯交换、内酯化、消除反应,C laisen重排反应:D iels2A lder反应、光分解和聚合、顺反异构化、脱羧、环氧化反应等[3]。

抗体酶在治疗方面也展现出灿烂的前景。

1　抗体的结构[4]抗体和酶一样是大分子蛋白质,由2条相同的轻链(大约2500D)和2条相同的重链(大约5000D)组成,见图1。

轻链由VL(可变区)和CL(不变区)组成,重链也由V H(可变区)和CH(不变区)组成。

重链和重链及重链和轻链之间通过二硫键相连。

此外重链还有一连接枢扭。

抗体的结合部位由6个超变区组成。

对同类型抗体CL和CH部分氨基酸的序列相同,然而VL和V H是非常专一的。

可变区大约由110个氨基酸组成,至少可产生108个不同抗体,它是抗体多样性的基础。

Fab片断由轻链和重链V H及CH1组成。

抗体2抗原复合物是借助范得华力,疏水作用,静电作用及氢键作用而形成。

杨玉社　男,34岁,博士,从事抗菌药物、抗肿瘤药物及相关领域研究。

1996211225收稿图12　抗体酶的产生方法211　细胞融合法[5]此方法是Schu ltz等首次使用的方法。

其过程如下:要得到一特定抗原的抗体,如果抗原是小分子,必须将其和载体蛋白相联。

然后对此抗原进行免疫,使宿主有机体针对抗原产生抗体,产生抗体的脾脏细胞与骨髓细胞相融合。

融合得到的杂交细胞既能产生抗体又能在体外培养。

通过选择培养,杂交细胞得以存留。

将杂交体克隆化,即繁殖成母体的同一细胞或分离成菌落。

这些菌落能够产生单一均匀的抗体。

对这些菌落用酶联免疫吸收实验加以筛选,以评价其选择性结合抗原的能力。

然后把抗原结合到一种固体支撑物上,再加入含有抗体的介质,这样抗原2抗体复合物随即形成,经过提纯就得到AB2A G复合物。

212　抗体结合点位化学修饰法[4]抗体酶和酶一样也可以用化学修饰的方法加以改造。

对抗体酶进行结构修饰的关键是找到一种温和的方法在抗体结合位置或附近引入具有催化功能的基团。

游离巯基就是适合的基团之一,它具有高亲核性,易于氧化,及能通过二硫化物进行交换反应或亲电反应而选择性修饰的特点。

Schu ltz等在IgAM O P315抗体结合部位选择性的引入了亲核性的巯基。

其方法如下:用含有易裂解键(如二硫键或硫键)的亲和力标记试剂,在N aCNBH3存在下,对抗体进行亲和力标记,将标记的抗体通过亲和力色谱而纯化,然后标记物被裂解形成活泼的二硫化物。

大量的催化基团能够通过二硫化物的交换反应而引入。

通过此方法,在IgAM O P315抗体的结合部位引入了巯基(2SH),其催化香豆酯水解的速度比照样相提高了6×104倍。

213　引入辅助因子法[6]很多天然酶活性中心都含有金属离子。

L erner等将金属离子引入抗体酶,成功地催化了肽键的选择性水解。

他们用三乙撑胺Co3+盐作为金属离子辅因子,所用半抗原分子带有一肽键。

且通过羧酸根及仲胺基与金属离子相连。

将此半抗原通过共价键连接在载体蛋白上免疫动物后产生的抗体,在金属离子复合物作为辅因子的参与下,这些抗体酶能选择性水解甘氨酸和丙氨酸之间的肽键,其转化数达6×10-4。

214　用生物工程的方法产生抗体[7]生物工程用于抗体酶技术正在大大加速其研究进展。

Scri pp s研究院的研究人员开创了一项革命性的技术——在体外制造抗体片断即Fab片断。

Fab片断由轻链和重链的V H及CH1部分组成,作为一种催化剂,抗体酶有这样的片断就行,无须完整的抗体分子。

有了这种新技术,科学家们就无须在要得到一种新的抗体时,就要用抗原给老鼠注射一次,而是从人或动物的抗原中抽取基因,然后用酶反应复制基因的聚合酶链反应(PCR)技术重新铸造轻链和重链,这样就可以把这些基因组合成100万个含有成对轻链和重链的基因库。

这些基因库是存储在细菌病毒里,通过随机地将基因和轻重链结合的方法,就可大量制造Fab片断了。

片断里的基因是通过细菌的形式表达出来的。

这样就可在细菌培养中繁殖数百万计不同抗体,将它们用于催化反应比使用老鼠杂交细胞更快更方便。

3　抗体酶的催化特征[8]311　动力学特征抗体酶催化反应和酶相似,包括抗体对底物的非共价键识别,然后将底物转化为产物,呈现饱和动力学特征并符合米氏动力学。

312　抗体催化反应的专一性另一个特征是催化反应具有专一性,包括区域及立体专一性。

313　催化抗体的熵陷阱催化抗体的另一特点是可以降低某些反应的熵势垒。

在诸如C laisen重排及D iels2A lder反应中,底物和抗体的结合能可用以冻结反应的平移,旋转等运动。

4　抗体酶的应用411　抗体酶在有机化学中的应用[9]41111　催化羧酸酯和碳酸酯水解[1,2]抗体酶催化的第一个反应是打破羧酸酯和碳酸酯中弱的碳氧键。

1986年L erner和Schu ltz独立地发表了他们关于抗体酶催化羧酸酯水解的第一篇报告。

羧酸酯和碳酸酯的水解是通过一个带负电的四面体过渡态完成的。

对应的磷酸酯是它们稳定的过渡态类似物,因此L erner 等合成了一系列磷酸酯作半抗原接上载体蛋白培养单克隆抗体。

如期所料,产生的抗体能催化羧酸酯和碳酸酯的水解,见图2。

抗体酶水解酯具有高度的立体专一性。

B enkovic和Schu ltz两小组将此方法用于产生抗体酶以水图2解那些不活泼的烷基酯。

他们发现有9种抗体催化(R)2苯基酯水解,而有两种抗体催化(S)2酯水解。

对其中两株抗体进行了深入研究,它们加速(R)2酯和(S)2酯水解的速度分别比背景实验快80万倍和1600倍,R S选择性大于98%。

图3图441112　催化消除反应及还原反应[10]Schu ltz利用电荷互补概念以7为抗原产生了结合位置有羧基负离子的抗体酶[4],此抗体酶具有适当排列的羧基负离子,能催化Β2氟代酮消除H F的反应。

他们用一个铵离子替换底物的可置换氢作为半抗原,产生的抗体大多能催化消除反应。

如所预料的那样,具有正电荷的抗原所诱导的抗体中其羧基负离子正好位于可置换的质子成键距离之内,此羧基负离子在生理pH之下是一种良好的碱,Pka=6.2。

同位素证明Β2氟代酮消除反应的rds为去质子步骤,见图4。

41113　内酯化反应[11]∆-羟基羧酸酯的分子内环化反应,也能用抗体酶催化。

用化合物8为半抗原(8为单一构型的立体异构体。

)培养单抗。

其中24B11抗体可催化∆2羟基内酯9的内酯化,而且显示出强的立体选择性。

24B11催化外消旋9环化反应,发现只有50%可被环化,其余50%还是未反应的9。

环化产物10具有很高的ee值,见图5。

41114　C laisen重排反应[12]分支羧盐转化为预苯羧盐是一个典型的生物C laisen重排,这是细菌,真菌,植物体内芳香氨基酸生物合成的关键一步,由分支羧盐变位酶催化。

此反应可用抗体酶催化,反应通过一不对称椅式过渡态。

用过渡态类似物培养抗体,产生的抗体酶催化此反应的效率比天然酶高数百万倍,抗体催化此反应的活化熵为零。

相比之下,无催化剂时该反应的熵为213单位,证明熵陷阱在此反应中的重要性。

同时抗体酶只催化(2)2分支羧盐的C laisen重排,见图6。

图641115　催化D iels2A lder反应[5]D iels2A lder反应出现一个高度有序的过渡态,其活化熵一般在230到240单位之间。

因此通过把两个反应底物结合到抗体的活性部位,应当能极大地加速D iels2A lder反应的速度。

H ilvert用16作为半抗原产生的抗体催化N2乙基马来酰亚胺与四氯噻吩二氧化物加成,因为反应中有二氧化硫放出,产物阻化作用应很小。

确实,分离出的抗体促进了D iels2A lder反应,其有效浓度至少达110M 结合位置,转化数K cat=50。

催化D iels2A lder反应的成功有非常重大的意义,因为自然界中不存在催化D iels2A lder反应的酶,这是人类智慧与技巧胜过自然界的例证,见图7。

41116　催化环氧的开环反应[13]空间电子约束,17中的环氧开环反应一般有利于生成四氢呋喃衍生物18,但Scri pp s研究人员用19为半抗原,激发一种专一免疫反应,产生的抗体酶催化17产生了新的开环方式,生成四羟基吡喃产物20,见图8。

天然酶只能加速反应速度,而不能改变反应产物,抗体酶则不然,正如Janda[14]所说:抗体酶可以创造新的化学反应。

有人甚至说,抗体酶的进一步发展,有可能改变整个化学工业的格局[15]。

图841117　催化酰胺键和肽键的水解[16]肽键水解是有一定能量要求的反应。

L erner和Schu lts曾认为催化这样的反应是他们的长期战略目标,然而这项工作已经取得突破性进展。

L erner小组用固相合成法合成了半抗原21,将其联接到载体蛋白上,免疫动物后产生的抗体在金属离子Co3+存在下,这些抗体能专一性催化水解22中甘氨酸与丙氨酸之间的肽腱,未来的挑战将是发展能选择性催化水解我们感兴趣的其它肽和蛋白质序列。

41118　其它应用[5]抗体酶在化学领域还有很多用途。