光路
流路
流式细胞分析分选原理
流路
• 单细胞悬液 • 大多数仪器是在50-300 µm 大小的孔径中,
将细胞悬液注射进入鞘液中 • 这一过程,成为流体动力学聚焦
流式细胞分析分选原理
FLOW CELL
Injector Tip
Sheath fluid
Fluorescence signals
Focused laser beam
Scale
1000 200 100 50 40 30 20 15 82来自0400600
800
1000
0
Neutrophils
Monocytes
Lymphocytes
0 200
400
600
800
1000
90 Degree Scatter
流式细胞分析分选原理
光路-荧光信号
• 每种荧光染料均有特定的激发波长, 并激 发后会有发射波长,流式细胞仪检测的即 是它特定的发射波长.
流式细胞仪与显微镜
光源 激光
自然光、灯光、氙(汞)灯
对象 细胞、生物粒子 承载工具 鞘液及流动室
细胞、生物粒子 载(盖)玻片
检测信号 光学信号 放大方式 PMT，放大电路
形态及染色 目镜X物镜
统计 结果
计算机，>5000 多参数，综合分析
人工，200 简单，单参数
流式细胞分析分选原理
流路
基本原理
Range over which a fluorescence
Range of emitted wavelengths for
compound may be excited 流式细胞分析分选原a理particular compound
5 Color Single Laser (488nm)
FITC/PE/ECD/PC5/PC7
• SS用于检测细胞内部结构 如:胞浆内颗粒多流少式细胞, 分核析分质选原理比
侧向散射光
流式细胞分析分选原理
流式细胞分析分选原理
流式细胞分析分选原理
Light Scatter Gating
Side Scatter Projection
ForwardScater rPjoection
ForwardScater
• 利用各种不同波长的光学滤片来收集(检 测)这些光学信号
流式细胞分析分选原理
荧光染料的特性 •激发波长(EXCITING) •发射波长(EMISSION)
流式细胞分析分选原理
Fluorescence emitted by each fluorochrome is usually detected in a unique fluorescence channel.
流式细胞分析分选原理
4 Color Single Laser (488nm) FITC/PE/ECD/PC5
流式细胞分析分选原理
常用荧光染料的特性
荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途
颜色
FITC
488
525
免疫荧光 绿色
PE(RD1) 488
575
免疫荧光 橙色
ECD
488
620
• FS用于检测细胞或其他粒子的表面属性
如:大小
流式细胞分析分选原理
前向散射光
流式细胞分析分选原理
流式细胞分析分选原理
散射光信号 – 侧向散射光
• SS-Side (Angel Light) Scatter 与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器, 也称为90度散射光检测器
• SS的强度与细胞或其他颗粒的大小, 形状 及 optical homogeneity 有关
• 这种方式的滤片称为二向色性滤片 ( dichroic filter)
流式细胞分析分选原理
标准带通滤片 band pass
630/30 nm BP
光源
通过的光谱
615-645 nm light
流式细胞分析分选原理
Source light
Absorbance filter
Certain colors absorbed
水冷
Innova300系列
Innova70系列
固态
流式细胞分析分选原理
检测信号
流式细胞分析分选原理
散射光信号—前向散射光(FS)
• FS----Forward (Angel Light) Scatter 在激光束正前方的检测器, 为前向散射光 检测器
• FS的强度与细胞或其他颗粒的大小, 形 状及 optical homogeneity 有关
• 流动室 • 鞘液SHEATH • 样本流SAMPLE 单细胞悬液5*105~1*106个/ml
光路
• 光源 • 检测信号 • 光电倍增管PMT HV
电路
• 放大电路HV及GAIN 增益 • A/D转换
• 统计：计算流机式细胞分析分选原理
流式细胞仪
光路
流路
电子
流式细胞分析分选原理
软件
软件
电路/ 电子
流式细胞分析分选原理
Passed light
流式细胞分析分选原理
The specificity of detection is controlled by the wavelength selectivity of optical filters and mirrors.
流式细胞分析分选原理
Absorption spectrum:
Emission spectrum:
流式细胞分析分选原理
软件
电路/ 电子
光路
流路
流式细胞分析分选原理
光路
光源
检测信号 散射光信号 FS: 前向角散射光 SS: 侧向角散射光(90度散射光)
荧光信号 荧光染料 光学滤片 颜色补偿
流式细胞分析分选原理
光路
• 光源 与通过的细胞聚焦在同一点上
• 激光
空冷
488nm blue, 633nm red, 325nm UV, 514nm green,
免疫荧光 橙红
PeCy5 488
675
免疫荧光 红
PI
488
620
DNA染色 橙红
PECy7 488
755
免疫荧光 深红
PerCP 488
670
APC
633
670
流式细胞分析分选原理
光路 - 滤片特性
• 当以 45o 角放置滤片时,该滤片可以通过 一定波长的光,同时也可以阻断并折射该 波长以下的光
流式细胞仪工作原理
流式细胞分析分选原理
流式细胞术的原理
• 流式细胞术（FCM）是一 种能对单个细胞、分子和 生物颗粒（微生物）进行 多参数快速检测的新型分 析和分选技术。近几年随 着多种单克隆抗体的成功 制备和多种荧光素的应用。 FCM逐步运用于对疾病诊 断和治疗监测的临床检验 常规工作。
流式细胞分析分选原理