喉癌组织中LCRG1基因启动子的克隆、突变和甲基化检测李金花;曾龙武;谢海龙【摘要】目的观察喉癌候选抑瘤基因(laryngeal carcinoma related gene1,LCRG1)启动子的功能.方法 (1)通过5′-缺失突变、瞬时转染与荧光素酶报告基因活性检测,进一步分析与LCRG1基因表达调控有关的最小启动子区域;(2)通过PCR-单链构象多态性(PCR-single-strand conformation polymorphism,PCR-SSCP)技术检测40例喉癌组织中LCRG1基因启动子突变;(3)应用甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MSP)技术检测40例喉癌组织中LCRG1基因启动子甲基化状态;(4)采用RT-PCR技术检测40例喉癌组织中LCRG1基因的表达.结果(1)LCRG1基因最小启动子片段位于转录起始位点上游-169~-57位点;(2)喉癌组织中LCRG1基因启动子无突变;(3)40例喉癌组织中有5.00% LCRG1基因启动子甲基化改变;(4)RT-PCR检测显示40%(16/40)喉癌组织中LCRG1基因表达下调.结论 LCRG1基因最小启动子位于转录起始位点上游-169~-57位点的DNA片段;LCRG1基因启动子甲基化部分改变可能参与该基因的表达调控.【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》【年(卷),期】2013(029)008【总页数】6页(P819-824)【关键词】转录调控;最小启动子;瞬时转染;甲基化【作者】李金花;曾龙武;谢海龙【作者单位】杭州师范大学附属医院病理科,杭州310015;南华大学肿瘤研究所,衡阳421000;南华大学肿瘤研究所,衡阳421000;南华大学肿瘤研究所,衡阳421000【正文语种】中文【中图分类】R739.65喉癌是一种严重危害人类健康的恶性肿瘤，其发生、发展过程复杂，涉及大量相关基因结构和表达调控的改变，瘤基因的激活和抑瘤基因的失活起到关键性作用，喉癌的发病分子机制至今仍未清楚[1]。

因此，分离和鉴定与喉癌发病相关的基因是阐明其癌变机制与易感性的关键，对临床诊断与治疗也有较为重要的意义。

喉癌的杂合性丢失(loss of heterozygosity，LOH)研究显示，在染色体 3p、8p、9p、13q、17p、17q上均有较高频率的 LOH[2，3]。

喉癌候选抑瘤基因(laryngeal carcinoma related gene 1，LCRG1)是喉癌中表达下调的新基因，定位于17q12～21.1上，位于D17S800～D17S930之间，正好位于17q21.1上的LOH的高频区域[4]。

研究显示，LCRG1在54.5%(6/11)的其它肿瘤细胞系中不表达[4]，当将野生型LCRG1 cDNA编码区导入到不表达该基因的喉癌细胞系Hep-2中，见其明显抑制细胞生长、Hep-2细胞的停泊非依赖性生长及抑制裸鼠成瘤[5]，这表明LCRG1具有一定的抑瘤功能。

然而，LCRG1在肿瘤尤其是在喉癌中的缺失或低表达的转录调控机制至今尚未清楚[6]。

课题组在既往的研究中已初步确定LCRG1基因的启动子片段及启动子区域内部分关键顺式调节元件[7－9]。

本研究从转录调控机制入手，应用多种实验方法对LCRG1基因启动子的表达调控机制进行研究，进一步提高该基因的认识和促进其功能研究的开展，了解该基因在喉癌中表达下调的分子机制。

1 材料与方法1.1 材料收集2005年1月～2008年6月南华大学附属第二医院和南华大学郴州市第一人民医院教学医院手术切除的喉癌根治术标本(所有标本均经患者及院方许可)40例，其中男性29例，女性11例，年龄52～72岁，中位年龄61岁。

40例喉癌组织中高分化18例，中分化9例，低分化13例。

早期喉癌(TNM分类0～Ⅰ期)6例，进展期喉癌(TNM分类Ⅱ～Ⅳ期)34例，有淋巴结转移者29例，无淋巴结转移者11例。

所有患者术前均未接受放、化疗。

COS7细胞株购自美国ATCC公司、人肝癌细胞7721来自南华大学肿瘤研究;DMEM、胎牛血清购自Hyclone公司;用于启动子活性分析的PGL3系列质粒及荧光素酶内参照质粒PRL-TK购自Promega公司。

DNA转染试剂Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司;双荧光素酶检测试剂购自Promega公司;质粒提取试剂盒购自Qiagen公司;各种限制性内切酶、DNA连接酶、胶纯化回收试剂盒均购自Takara公司;实验中所用引物均用Primer Premier 3.0软件设计，由上海英骏公司合成。

EZ DNA Methylation-Gold Kit试剂盒购自美国Zymo Research公司。

1.2 方法1.2.1 重组质粒的构建载体质粒pGL3-basic不含启动子和增强子，含萤火虫荧光素酶报告基因，重组体中所含启动子即是所要研究的LCRG1的5'端启动子片段。

6个构建的重组体分别命名为pGL3-E177(－169～ +8 bp)、pGL3-E112(－169～－57 bp)、pGL3-E89(－169～－78 bp)、pGL3-E88(－78～ +8 bp)、pGL3-E96(－57～ +39 bp)、pGL3-E180(－53～+127 bp)。

PCR扩增以pGL3-E296质粒为模板[6]，利用PCR技术将不同长度的启动子片段扩增出来，上、下游引物的5'端分别引入MluⅠ和XhoⅠ酶切位点。

扩增片段用MluⅠ和XhoⅠ双酶切后，连接到同样被这两种酶酶切的pGL3-basic载体中的多克隆位点内，构建含LCRG1 5'调控序列和萤火虫荧光素酶报告基因的重组质粒。

重组质粒经酶切和测序进一步鉴定。

构建的重组质粒和相对应的引物见表1。

另外重组体pGL3-E180(－53～+127 bp)的构建是将pGL3-E296用MluⅠ和NarⅠ双酶切消化后，加Klenow酶、dNTPs补平，电泳回收纯化载体大片段，用T4 DNA连接酶自连载体大片段，转化TOP10感受态菌，挑取转化子，抽质粒后用KpnⅠ和HindⅢ双酶切鉴定，产物中有约210 bp片段的为正确转化子，测序结果正确;重组体pGL3-E89(－169～－78 bp)是将全长pGL3-E177质粒分别用NruⅠ和XhoⅠ酶切消化后，Klenow酶补平，电泳回收并纯化含载体的大片段(约5 K)。

自连转化DH10B感受态菌，挑取转化子，抽质粒ScaⅠ酶切鉴定，测序结果正确;重组体pGL3-E88(－78～+8 bp)是将全长pGL3-E177质粒分别用NruⅠ和MluⅠ酶切消化后，Klenow酶补平，电泳回收并纯化含载体的大片段(约5 K)。

自连转化DH10B感受态菌，挑取转化子，抽质粒ScaⅠ酶切鉴定，测序结果正确。

表1 相关引物序列引物序列(5'-3') 产物长度(bp)E112 LCGACGCGTGGGCCCACGGGCGG 112 R CCGCTCGAGGGCGGGACCCACG E96 LCGACGCGTCGGCGCCCGACCCC 96 R CCGCTCGAGTTTCCTCTACGGGCAGTC E177 LACGCGTCGGGCCCACGGGCGGGACGG 177 RCTCGAGGCGGGGAGTGGAAGAAGGAG1.2.2 瞬时转染质粒转染按Lipofectamine 2000使用说明进行。

转染前一天，将COS7、7721细胞以5×104个/孔的密度接种于24孔组织培养板，当细胞生长至80% ～90%融合时，加入0.4 μg重组质粒、20 ng 的 PRL-CMV 及0.75 μl Lipofectamine 2000。

同时设立转染 pGL3-basic阴性对照组和pGL3-control 阳性对照组。

1.2.3 荧光素酶报告基因活性检测根据Promega公司Dual-Luciferase ReporterAssay Kit提供的操作步骤检测报告基因活性。

具体操作如下:每孔加入100 μl× PassiveLysis Buffer，室温裂解 10 min，用枪头刮下细胞后收集到1.5 ml Eppendorf管中，13 200 r/min×2，取20 μl上清加入测量管中，先加入Fire-fly Luciferase 底物30 μl，用 MiniLumat LB 9506(EG＆G ERTHOLD)仪器测量并记录读数，然后在该反应混合物中加入30 μl Renilla Luciferase底物，测量并记录读数。

以Firefly Luciferase读数与Renilla Luciferase读数比值(Ratio)作为相对Luciferase活性，即Relative Luciferase Activity，各缺失插入片段启动子活性均通过与阳性对照质粒pGL3-control比较(以pGL3-control启动子活性为100%)获得。

为减少误差，各实验至少重复3次，每次实验均设2个平行组，Mean表示两组的Ratio平均值。

标准偏差计算公式为1.2.4 组织DNA与RNA提取按《分子克隆实验指南》操作步骤提取细胞和组织标本的基因组DNA与RNA。

1.2.5 PCR-单链构象多态性(PCR-single-strand conformation polymorphism，PCR-SSCP) 利用Primer 3.0软件设计引物扩增LCRG1启动子区域，LCRG1-SSCP-F:5'-CCCTCCTACCAGTCCTAGTTCG-3'和LCRG1-SSCP-R:5'-CGTTTCCTCTACGGGCAGTC-3'。

以基因组DNA 0.5 μg为模板进行PCR反应，取PCR产物处理后电泳，回收电泳缓冲液，银染后的凝胶经凝胶成像系统成像、拍摄，电脑保存。

1.2.6 甲基化特异性 PCR(methylation specific PCR，MSP)DNA甲基化处理采用美国Zymo Research公司的EZ DNA Methylation-Gold Kit试剂盒。

LCRG1启动子区域包括一个CpG岛，即从转录起始位点上游－169 bp到－58 bp。

利用Methyl Primer Express Software v1.0和Primer 3.0软件设计两对引物，(1)LCRG1-BSP1-F:5'-GGTTGGGGTTTGAGG TTG-3'，LCRG1-BSP1-R:5'-AACTCCCACCTCTACTC CCTATTACTA-3';(2)LCRG1-BSP2-F:5'-TTTTTTTA TTAGTTTTAGTTTGGGTTTAG-3'，LCRG1-BSP2-R:5'-TTTCCTCTACAAACAATCAACCAC-3'。