实验项目一：总RNA的提取（必做）一、实验学时：6学时二、实验目的通过本实验学习总RNA的提取和分析方法。

三、实验内容利用匀浆裂解细胞，采用TRilzol试剂盒抽提RNA去除蛋白质和DNA。

四、实验要求学会提取基因组RNA的方法和操作过程提取RNA时，要特别注意防止RNase的污染，所用玻璃器皿均应用0.1％的二乙基焦碳酸盐(diethyl pyrocarbonate，DEPC)处理。

塑料器材均使用一次性用品，并高压灭菌处理，必要时，也可用0.1%DEPC处理。

五、实验所需仪器设备与试剂仪器：移液器及吸头，电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪等试剂：TRIzol 试剂、氯仿、异丙醇、75% 乙醇（DEPC H2O 配制）、DEPC H2O六、实验原理TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。

最大特点是可同时分离一个样品的RNA\DNA\蛋白质.TRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。

在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。

取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；七、实验步骤1. 颈椎脱臼法处死大鼠，打开大鼠腹腔，取出肝脏2. 将肝脏用ddH2O冲洗几遍，去除血液3. 将大鼠肝脏放入研钵，用剪刀剪成绿豆大小的组织块，4．冷冻离心机冷却到4℃（预冷半个小时）。

准备冰盒。

5．戴口罩，戴手套。

6. 每个EP管中，加入100mg左右的组织，加入1mL Trizol 试剂，7. 超声破碎仪破碎细胞8. 剧烈震荡30秒，室温静置10分钟。

9．加入200uL氯仿（三氯甲烷），剧烈震荡30秒，室温静置5分钟。

10. 离心：4℃，13,000rpm，10min。

11．取新EP管。

将上层水相（约600uL）加入新EP管，12. 再加入500uL异丙醇，室温静置10分钟。

13. 离心：4℃，13,000rpm，10min。

14. 去上清夜，加入20-30 uL DEPC水，55℃10min，以完全溶解RNA。

15 .-70度保存提取的总RNA。

八、注意事项1．RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶类，除了细胞内源RNA 酶外，外界环境中均存在RNA酶，所以操作时应戴手套。

2．RNA提取用品准备：1）普通的玻璃器皿：180℃烘干8小时（玻璃），研钵，小勺，试剂瓶若干个。

2）一次性使用的塑料制品：枪头、EP管等先用DEPC水处理然后高压灭菌，烘干。

3）用烘烤过的药勺称取试剂。

4）用DEPC水配制试剂：0.1%DEPC水：37℃至少处理12小时，高压灭菌15min。

实验结果:成功从植物中分离得到总RNA实验项目二：总RNA的纯化和鉴定（必做）一、实验学时：6学时二、实验目的通过本实验学习总RNA的纯化和利用琼脂糖电泳鉴定的方法三、实验内容1、通过选择性沉淀RNA分子去除DNA。

2、琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA四、实验要求1、学会纯化植物总RNA的方法2、学会定量、定性检测RNA的方法五、实验所需仪器设备移液器及吸头，水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪,照相机、紫外分光光度计六、实验原理乙醇能够消除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来。

在阳离子的足量时，可以中和暴露的磷酸残基的电荷，使RNA沉淀。

反复利用乙醇沉淀RNA，可以起到纯化RNA的作用。

由于细胞中70-80%的RNA为rRNA，总RNA电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。

动物rRNA大小分别约为5kb和2kb，分别相当于28S和18S rRNA；植物叶片中由于含有大量的叶绿体RNA，可见4条或更多rRNA；细菌rRNA大小分别约为4kb和2kb，分别相当于细菌23S和16S rRNA。

RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示RNA样品的降解。

出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。

OD260/OD280比值是衡量RNA样品中蛋白质污染程度的指标。

高质量的RNA样品，OD260/OD280值（10mM Tris, pH7.5）在2.0左右。

OD260/OD280读数受测定所用溶液的pH值影响。

同一个RNA样品，假定在10mM Tris，pH7.5溶液中测出的OD260/OD280读数在1.8-2.1之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间，但这并不表示RNA不纯。

取一定量的RNA提取物，用RNase-free水稀释n倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度（ng/μl）=OD260×n (稀释倍数)×40七、实验步骤（一）总RNA的纯化1．提取的总RNA，加入75%乙醇500uL洗涤。

2. 离心：4℃，7,500rpm，5min。

3．去上清液，加入无水乙醇500uL洗涤。

4 离心：4℃，7,500rpm，5min。

5．去上清液，空气干燥5-10分钟。

（RNA不可以完全干燥，防止复溶的时候困难）6. 加入20-30 uL DEPC水，55℃10min，以完全溶解RNA。

（二）总RNA质量的检测（完整性的检测）1．称取琼脂糖0.25 g，溶于盛有30ml的 50×TAE（电泳缓冲液）的锥形瓶中；母液为50×TAE: 242 g Tris 碱+ 57. 1 ml 冰醋酸+ 37. 2 g Na2EDTA·2H2O 配成1L 于4 ℃储备)，2．将上述液体置于微波炉中火煮2-3分钟（以琼脂糖完全熔化为准）；加热时应盖上盖子,以减少水份蒸发。

3．在微波的过程中取出电泳板放在干净的一次性手套上，用清洁的挡板封住电泳板的两端形成模具；4．从微波炉中取出已经完全熔化的凝胶溶液，片刻冷却后，用吸管吸一定量的凝胶溶液将电泳板的两边封住；5．向锥形瓶中加入10 mg/ml的溴化乙锭（EB）1 µl（终浓度0.5 µg/ml，EB插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间后，能形成一种在紫外光下发光的络合物，容易观察）,轻轻地旋转以充分混匀凝胶溶液；6．将凝胶溶液匀速倒入电泳模具中（避免出现气泡）；倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。

如果出现明显的气泡，可用刀片赶走，然后插入合适的梳子形成加样孔。

梳齿的位置应在电泳板底面以上0.5 ~ 1.0 mm,这样琼脂糖浇灌到电泳模具中时将形成符合要求的加样孔；7．让凝胶溶液在室温下完全凝结（需1 h左右）后小心将梳齿拔起；待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶。

8．将凝胶安放到电泳槽内，向电泳槽加入电泳缓冲液（1 ´ TAE），要求没过凝胶；因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。

9．在干净的一次性手套上混合RNA样品和6 ´ 上样缓冲液（5 µl 样品混合1 µl 6 ´ 上样缓冲液）；10．用枪将样品混合液缓慢加入点样孔内；每加完一个样品要更换tip头,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。

并加入4ul的DNA marker，作为标记。

11．接好电极插头。

出孔电压为100 v（约2min）；出孔以后电压用70 v，电流在40mA以上；电泳30分钟左右，当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳，关上电源。

注意DNA或RNA的泳动方向，防止反方向泳动而跳海。

12 观察：在波长为254nm的长波长紫外灯下观察电泳胶板。

RNA 存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。

紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩,以免损伤眼睛。

电泳可见明显两条带，RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍，说明抽提的RNA质量高。

常用电泳缓冲液制备：1×TAE: 40Mm Tris-乙酸 1mM EDTA1×TPE: 90mM Tris-磷酸 2mM EDTA0.5×TBE: 45Mm Tris-硼酸 1mM EDTA凝胶加样缓冲液：0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青FF 40%蔗糖或（15%聚蔗糖400 30%甘油）（三） RNA浓度与纯度的检查1．取样本RNA 1 µl加99 µl DEPC处理水（稀释100倍）；2．准备一管DEPC处理水以调零；3．开仪器后部的开关；4．按“RNA”键即为检测RNA；5．取比色皿一个，用DEPC处理水洗一遍；6．加DEPC处理水到比色皿后将比色皿放置在仪器指定位置，按“blank”键调零（放比色皿时注意光面和毛面；手接触毛面，光线透过的应该是光面）；7．取出比色皿，吸干前液；8．吸样品液到比色皿的凹槽内，将比色皿放置在仪器指定位置，按“sample” 键后记录下仪器显示的样品浓度和A260/A280值（其比值可以判断核酸样品的浓度，对于DNA样品比值应在1.6-1.8之间，小于1.6有蛋白质的污染，大于1.8有RNA污染对于RNA比值应在2.0以上，如果小于2.0表示蛋白质或苯酚的污染。

）9．实验结束后将比色皿洗干净备用。

10. 以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度（ng/μl）=OD260×n (稀释倍数)×40八、注意事项1．RNA纯化时动作轻柔，防止RNA分子断裂2. 防止RNA酶水解RNA3. 乙醇沉淀RNA时，不可完全干燥，否则不可以RNA难以复溶4. 由于细胞中70-80%的RNA为rRNA，电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。

动物rRNA大小分别约为5kb和2kb，分别相当于28S和18S rRNA；植物叶片中由于含有大量的叶绿体RNA，可见4条或更多rRNA；细菌rRNA大小分别约为4kb和2kb，分别相当于细菌23S和16S rRNA。

RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示RNA样品的降解。

出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。

5.不同组织或细胞中提取RNA预期得率植物叶片100－200 μg/g 叶片动物组织200－400 μg/g 肝脏组织动植物培养细胞5－10 μg/106细胞革兰氏阴性细菌2－10 μg/ml DH5α过夜菌血液3－5 μg/ml 人全血实验结果：电泳可见明显两条带，RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA 亮度的1.5-2.0倍，说明抽提的RNA质量高。

并且紫外分光光度法测得的RNA的浓度和纯度复合实验预期，可以进行下一步的RT-PCR的实验。

实验项目三：PCR基因扩增一、实验学时：6学时二、实验目的通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。