采用2只光径1.0厘米洁净的石英比色杯，分别倒入蒸馏水4.0毫升和牛血清白蛋白 标准品或测试样品溶液4.0毫升于各比色杯中，以蒸馏水（或溶剂）为空白溶液，调仪 器零点（具体方法详见仪器操作说明书）。标准品或测试样品溶液在250—300 nm波长 的范围内，以每间隔5个nm波长依次测定，同时记录各波长蛋白质溶液的吸光值于表1 中（结果见表1）。在每次更换测定波长时均需要重新调节仪器零点后，方能测定。
友情复叙
（1）、需要强调的是：紫外、可见分光光度法测定样品时都需要用一个“空白管”， 它主要是用于仪器校“零点”用。空白管一般又习惯称“零管”和“对照
管”。
（2）、能作为“零管”溶液的条件？一般要求是：被测定的溶质的溶剂作为零管溶 液，但是如果实验本身要求不高或所用溶剂与蒸馏水在某一特定的波长吸 光度差异很小（比较过），也可以直接用蒸馏水甚至自来水代替。
紫外分光光度法
测定蛋白质吸收光谱曲线
一 实验原理
蛋白质所含有的一些芳香族氨基酸（主要是苯丙氨酸，酪氨 酸）具有共轭双键结构能够产生π→π﹡及n→π﹡类型的电子跃迁， 因此能够在近紫外光区产生光吸收，并且在280 nm波长处有一特征吸收 峰。利用这一特性，通过对蛋白质紫外吸收光谱曲线的测定，可以进行 定性分析。
0 240 250 260 270 280 290 300 310
波长（nm）
吸光度(A)
吸光度(A)
图1、牛血清白蛋白在250—300 nm波长吸收光谱曲线图
牛血清白蛋白紫外吸收光谱曲线
0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
0 240 250 260 270 280 290 300 310 波长（nm）
5-2、蛋白质的紫外吸收光谱曲线的制作
以表1测定的波长为横坐标，相对应的吸光度为纵坐标对应作图。然后分 别将图中各点用线连起来，即得到蛋白质的紫外吸收光谱曲线，其中吸收峰所 对应的波长即为蛋白质最大吸收波长，结果见图1。
图1 蛋白质的紫外吸收光谱曲线图
牛血清白蛋白紫外吸收光谱曲线 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
（3）、在特征吸收峰附近波长间隔尽量要小，否则会错过真正的特征吸收峰值。特 征吸收峰通常又称最大吸收峰，如蛋白质、核酸分别在280nm和260nm时的 吸收值最大。
（4）、在吸收光谱曲线及含量的测定中，要达到结果的准确性，除了自身的操作水 平外，还要保证分光光度计的波长精度(除校正外，还有厂质，所以 要写仪 器型号，厂名)，以及有关测定样品的溶剂，pH,离子强度，温度以及其他相 关条件的一致性,否则会给实验结果带来差异，既不一致性。
四 试剂及配制Leabharlann 4-1 牛血清白蛋白 [试剂纯,上海试剂有限责任公司]
牛血清白蛋白溶液的配制（1.0 毫克/毫升）：
称取牛血清白蛋白标准品50毫克，置于50毫升容量瓶中，先加适 量蒸馏水将其溶解，然后补加蒸馏水定容至刻度，混匀后即浓度 为1.0 毫克/毫升的溶液。
五 操作步骤与结果
5-1、蛋白质的紫外吸收光谱曲线的测定
二 实验目的与要求
（1）、了解紫外分光光度仪的基本原理和使用方法。 （2）、学习和掌握紫外吸收光谱曲线的制作方法。 （3）、了解和掌握蛋白质的定性原理。
三 实验主要仪器与器材
3-1、实验仪器
（1）、 紫外分光光度仪 （2）、 混合器 （3）、 天 平
3-2、实验器材
（1）、 定容瓶 （2）、 烧 杯 （3）、 滴 管 （4）、 骨 勺 （5）、 称量纸 （6）、 剪 刀 （7）、 镊 子 （8）、 洗 瓶 （9）、 玻 棒 （10）、记号笔 （11）、标签纸 （12）、坐标纸
对测定波长的范围和间隔大小，可根据不同样品的实际情况和要求加以确定。
牛血清白蛋白标准品溶液在不同波长测定结果
表1 - 牛血清白蛋白样品溶液在250—300 nm波长吸光度结果表 波 长（nm） 250.0 255.0 260.0 265.0 270.0 275.0 277.5 吸光度 (A) 波 长（nm） 280.0 282.5 285.0 290.0 295.0 300.0 305.0 吸光度 (A)