禾本科植物联合固氮研究及其应用现状展望3张丽梅　方　萍33　朱日清(浙江大学环境与资源学院,杭州310029)【摘要】　综述了近年来从禾本科植物体内和根际发现的内生固氮菌和根际固氮菌的种类、特征及对宿主的促生机理,以及固氮菌接种剂在农业生产中的应用现状和存在的问题,指出影响联合固氮菌接种效果的主要因素有土著微生物的竞争;植物基因型差异和环境条件的变化,如结合态氮(氨、亚硝酸盐、硝酸盐等)对固氮酶的合成阻遏和较高的氧分压对联合固氮菌的固氮效率影响.提出了发掘和利用禾本科植物的生物固氮潜力的努力方向:从自然界分离筛选获得广谱高效固氮菌株;应用基因工程构建耐铵、泌铵型联合固氮菌;诱导禾本科植物形成固氮根瘤;充分发挥植物内生固氮菌的优势.关键词　禾本科植物　联合固氮　根际固氮菌　内生固氮菌文章编号　1001-9332(2004)09-1650-05　中图分类号 Q945179文献标识码　AR ecent advances in research and application of associated nitrogen 2f ixation with graminaceous plants.ZHAN G Limei,FAN G Ping ,ZHU Riqing (College of Environmental and Resource Sciences ,Zhejiang U niversity ,Hangz hou 310029,China ).2Chin.J.A ppl.Ecol .,2004,15(9):1650～1654.The category ,characteristic of diazotrophs isolated from inside and/or rhizosphere of graminaceous plants in re 2cent year and the mechanism of the promoting effects on their host plant were reviewed in this paper.The cur 2rent status of application of associative nitrogen 2fixation inoculants and the problems in inoculation were dis 2cussed.It was indicated that the main factors influencing the effects of inoculants include the competition of in 2digenous micro 2organism with inoculants for nutritions and energy ,difference of host plant genotypes in associa 2tive relationship ,and variance of environmental conditions such as the concentration of ammonium in soil solution and the oxygen partial pressure in soil air.The trends of future research in this field were prospected ,for exam 2ple ,to isolate and identify the high nitrogen fixing efficiency strains with wider environmental adaptability ,to create associative nitrogen fixing bacteria strain which is able to bear or endure higher concentration of ammoni 2um by gene engineering technique ,to induce graminaceous plant forming root nodule for nitrogen fixation and to exert the predominance of endophytic diazotrophs.K ey w ords Graminaceous plants ,Associative nitrogen fixation ,Rhizosphere diazotrophs ,Endophytic dia 2zotrophs.3国家自然科学基金资助项目(30070443).33通讯联系人.Tel :0571286980595;E 2mail :pfang @ 2003-05-31收稿,2003-12-11接受.1　引 言生物固氮研究已有百余年历史,而作为其中的一个重要分支———联合固氮的研究,则只有几十年的历程.1958年,D bereiner 和Ruschei 等[3]首次从热带甘蔗的根际分离到固氮细菌:拜叶林克氏菌(Beijerinckia f luminensis ),并证实禾本科植物同样存在生物固氮潜能.1975年,D bereiner [19]实验再次发现与禾本科植物联合共生的固氮菌:固氮螺菌(A 2zospirillum ),并提出根际联合固氮的概念,认为根际中存在一类自由生活的能固氮的细菌,定殖于植物根表或近根土壤,部份则能侵入植物根的皮层组织或维管中,靠根系分泌物生存繁殖,与植物根系有密切的关系,但并不与宿主形成特异分化结构,将植物与细菌之间的这种共生关系称为联合共生固氮(associative symbiotic nitrogen fixation ).继D bereiner 等的发现之后,又相继发现许多具有重要经济价值的禾本科作物如甘蔗、水稻、玉米、牧草等存在明显的生物固氮现象,引起了人们对禾本科植物生物固氮的极大关注.然而,由于联合固氮菌与宿主植物根系之间只是一种松散的联合关系,没有分化出有形结构,使该领域的研究具有较大难度,且由于受多种因素的影响,联合固氮效率不及共生固氮高,限制了联合固氮接种剂在农业中的应用.近年来,随着一些新的研究手段包括化学分析、遗传工程、分子生物学、免疫学等方法的运用,推进了联合固氮领域的研究深度.2　联合固氮菌种类及其特性 自根际联合固氮菌的概念提出以来,相继从禾本科植物根际发现了许多新的联合固氮细菌,如醋酸固氮菌(Aceto 2bacter diazot rophics )、草螺菌(Herbaspirillum seropedicae )、内生固氮菌(A zoarus spp.)、产碱菌(A lcaligenes )、固氮螺菌(A zospirillum )、芽孢杆菌(B acillus )、肠杆菌(Enterobacter )、克雷伯氏菌(Klebsiella )、假单胞菌(Pseudomonas )、固氮根瘤菌(A zorhizobium )等.应用氮素平衡法、15N 同位素稀释法和15N 自然丰度技术证实了一些热带禾本科植物特别是甘蔗应用生态学报　2004年9月　第15卷　第9期 CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,Sep.2004,15(9)∶1650～1654(S accharus spp.)、湿生水稻(Oryz a sativa)和卡拉草(L ep2 tochloa f uscu)能通过生物固氮获得其生长所需的部分氮源[31].根据禾本科植物联合固氮细菌的生理生态特征可将其大致分为三类:根际固氮菌、兼性内生固氮菌和专性内生固氮菌.211　根际固氮菌包括定殖于植物根表的所有固氮细菌,如雀稗固氮菌(A zotobacter paspali)、拜叶林克氏菌(Beijerinckia spp.).许多研究表明,这类细菌对宿主植物的有益影响主要在于其产生的植物激素改变根系形态而促进植物的生长,因此也将这类菌归为根圈促生细菌(plant2growth promoting rhizobacteri2 a)[7,60].Boddey等[10]发现,在A zotobacter paspali与Paspalum notatum cv.batatai的联合共生系统中植物每年可通过生物固氮积累氮素20kg・hm-2,且这种联合共生关系具有严格的专一性.但参与这种专一性联合共生关系的化合物还不清楚,推测可能与在根瘤菌2豆科植物共生关系中起作用的分子信号类似.拜叶林克氏菌(以B.indica和B.f luminensis为主)主要与热带甘蔗形成联合固氮关系.研究发现,植株根系能分泌一些含糖化合物,而这种细菌能优先定殖于含糖化合物释放处,推测植株通过这些分泌物来调节这种细菌在根部的定殖并形成优势菌群[3].212　内生固氮菌内生生物(endophyte)原意是指在植物根内定居而不对植物造成伤害,在植物组织内生活而不引起植物病害的微生物(细菌和真菌).后来该定义被延伸,指在土壤中生存能力低,而主要定殖于植物根内部并能促进植物生长的一类微生物.由于一些细菌主要定殖于禾本科植物根内,且能与植物进行联合固氮,因此D bereiner将“endophyte”这个概念引入该领域,称为内生固氮菌[22,33].根据内生固氮菌的特点不同,又可分为兼性内生固氮菌和专性内生固氮菌两类. 21211兼性内生固氮菌　该类固氮菌既能在根内也能在根表和土壤定殖,主要为固氮螺菌属的细菌.该属细菌为革兰氏阴性菌,能利用多种碳源和氮源进行代谢,在不良环境下形成胞囊,同时分泌大量胞外多糖,并在体内形成聚β羟基丁酸作为能源以渡过不良环境[51].目前已分离鉴定出的有5个种.1)产脂固氮螺菌(A.lipof erum):可利用柠檬酸、葡萄糖为碳源;具N2O还原酶基因,能同化亚硝酸盐及亚硝态氧化物;能产生植物激素,存在IAA合成基因[14,54].2)巴西固氮螺菌(A.brasilense):能利用柠檬酸为碳源,但不能利用葡萄糖;具N2O还原酶基因;存在IAA合成基因[14,54].3)亚马逊固氮螺菌(A.am azomense):能利用蔗糖,并能在较广p H值下生存;无N2O还原酶基因;能产生植物激素,存在IAA合成基因[14].4)伊拉克固氮螺菌(A.irankense):能利用蔗糖作为碳源,并能水解果胶,耐高浓度盐(盐浓度可达3%);无N2O还原酶基因;不存在IAA合成基因[14,34].5)A.halopraef erens:从盐碱性土壤中分离到,在高盐浓度下生长和固氮,固氮的最适温度为41℃[42].近年在基因水平上的研究取得了一些进展,发现固氮螺菌具有一些与根瘤菌同源的基因.这些基因在根瘤菌中调节着细菌2植物间的共生关系.21212专性内生固氮菌　是一类具有独特生理生化特征的固氮菌,在土壤中不能生存或生存能力很差,而以相当高的数量存在于植物组织内.这一类群包括属于原细菌α亚纲的醋酸固氮菌(Acetobacter diazot rophicus)和属于原细菌β亚纲的固氮弧菌(A zoarus spp.)、织片草螺菌(Herbaspirillum seropedicae)、红苍白草螺菌(H.rubrisubalbicans)、B urkholderia spp.这类细菌主要从植物根表皮细胞或次生根形成点的细胞间隙处感染植物,经木质部扩散至植株上部[13,43,49]. 1)醋酸固氮菌:具有一定的宿主专一性,主要是一些含糖丰富的植物如甘蔗、甜马铃薯、喀麦隆草等[44].能耐高浓度糖(10%)渗透;在酸性(p H<5)条件下生长和固氮;缺乏硝酸盐还原酶;固氮酶活性不受高浓度的NO3-(25mM)影响,高糖渗透下NH4+能部分抑制固氮作用;耐氧,具有泌铵能力[44,50].含质粒,大小在50～110MDa,在染色体上有nif 基因位点.其遗传多样性有限.这可能与寄主范围较窄及内生环境相对稳定有关[52]. 2)织片草螺菌:宿主范围广,从禾本科植物玉米、高粱、水稻、甘蔗、牧草和非禾本科植物油棕中都分离到[3].能在高蔗糖浓度下生长,但不利用蔗糖而偏好有机酸;固氮酶活性仅被10mM的NH4+部分抑制;耐氧.nifA基因已被克隆和测序,用nifA启动子区缺失的突变株研究发现nifA蛋白的表达受NH4+阻遏,但不受氧阻遏[29,39]. 3)红苍白草螺菌:宿主较专一,多局限于甘蔗,但最近也从高梁、水稻、油棕中分离到.偏好有机酸,不能利用乙酰氨基葡糖,但能利用内消旋赤藓糖醇.能引起某些甘蔗品种的条纹病,以前将该菌错归为假单胞菌属(Pseudomonas),基于其DNA:rRNA同源性及一些生理特征,现将其归为草螺菌属(Herbaspirillum)[4,25]. 4)固氮弧菌:是卡拉草中的优势菌群.在有机酸中生长良好,不能利用碳水化合物,只能利用少数氨基酸;已检测到该菌能产生纤维素酶如胞外葡萄糖酶(exoglucanase)和内葡聚糖酶(endoglucanase).这两种酶可能与细菌入侵组织有关[28].菌体内膜堆叠成管状,利用固氮酶抗血清的研究认为该膜可能是固氮作用的功能膜,称为“diazosome”[27]. 5)B urkholderia spp.:近来从水稻、木薯及某些水果上分离到.3　联合固氮菌的农业应用及存在的问题 针对长期单一施用化学肥料带来的土壤肥力下降,农产品品质下降和农业环境面源污染加剧等一系列对农业可持15619期 张丽梅等:禾本科植物联合固氮研究及其应用现状展望 续发展的负面影响,鉴于业已发现的联合固氮菌的宿主植物大多为具有重要经济价值的作物如甘蔗、水稻、小麦、玉米、牧草等不能自主固氮的禾本科植物,积极发掘和利用联合固氮作用的潜力对农业可持续发展更具特殊的意义.大量的试验表明,联合固氮菌可通过以下方式促进植物的生长:1)直接将固定的铵分泌到菌体外供宿主植物利用或等菌体死亡消化后释放出氮为宿主植物提供氮源[5,15,18,35,57];2)产生植物生长调节物质,如IAA、ABA等影响根的呼吸速率和代谢,刺激根毛和次生根的形成,促进宿主植物对营养物质的吸收[23,28];3)微生态调节,当联合固氮菌在根际微域或植物体内部形成优势菌群后,可以起到调节根际生态平衡,阻止有害菌的入侵和定殖,起到生物屏障的保护作用[58];4)其它作用:如联合固氮菌在植物根部定殖可使宿主根的质子流增加而刺激植物对矿物质的吸收,或增加硝酸盐还原酶的活性而有助于植物吸收同化土壤中的氮素[6,9]. 近年来,利用联合固氮菌作为田间接种剂的研究已在世界各国广泛开展,并取得一些可喜的成绩.Okon等[38]评价了20多年来很多国家采用野生型固氮螺菌作为菌剂在田间接种,以统计学上有意义的增产率5%～30%计算,认为60%～70%的接种试验是成功的,但主要作用应归功于固氮菌产生的植物激素.近10多年来,许多研究报道相继证实了植物内生固氮菌的存在及其对宿主植物显著的氮营养贡献.巴西种植甘蔗有上百年的历史,蔗田施氮量一直不高但持续高产,而土壤氮储量并不下降,用15N稀释法和氮素平衡法研究表明,感染内生固氮菌的甘蔗可从生物固氮获得总氮量60%的氮素,有些品种甚至可达80%[2,11,16,21].更多的报道也证实了渍水水稻中内生菌明显的固氮作用[12,51].我国自“七・五”起就开始了水稻联合固氮的研究,随后进行了大规模的联合固氮菌剂的试验研究、示范和推广应用.据中国农业科学院1993～1994年向全国20个省、市、自治区所作的调查结果表明,小麦、水稻、玉米使用相应的根际联合固氮菌剂可增产10%左右[37,55].之后,国家“863”计划课题组开始采用生物技术方法构建基因工程固氮菌株,并将通过鉴定的三株耐铵工程菌:粪产碱菌(A lcaligenes f aecalis)A1523、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)E2613、催娩克氏杆菌(Klebsiel2 la oxytoca)N G1390,在全国南北方12个省、市、自治区进行试验、推广应用,面积达3.2×105hm2,各地资料汇总分析表明水稻以0.3～0.75kg・hm-2菌剂浸种均有不同程度的增产效果,增产幅度为5.1%～7.4%[37].李永兴等[36]通过3年田间小区试验证明,在玉米上接种导有nifA基因的耐铵工程菌产气肠杆菌(Enterobacter gergoviae)E7与接种野生型及无菌载体相比在增产和节肥上有明显效益,在肥力较低的白浆土、砂壤土中增产幅度可达12.3%,且这个结果有较好的规律性和重现性.然而,相当多的试验研究也得到不一致的结果,施振云等[47]对2年3个试验点产量进行多年多点试验结果联合分析发现,联合固氮菌在习惯用肥量下能有效提高玉米苗期品质,明显增加玉米每穗数6.1%而获得7. 5%的增产率,而在不施肥条件下,增产效果不显著.张英[59]研究也表明,在水稻、小白菜、莴苣上接种根际联合固氮菌有明显的增产趋势,但多数性状未达显著差异,因此认为,在生产上用联合固氮菌剂完全替代氮素肥料是不切实际的,但可作为一种辅助的农业措施.我们应用固氮螺菌NO40在红壤性水稻上的接种结果显示,接种后水稻新展开叶的叶绿素含量、株高及秸杆干物重有显著提高,但水稻的增产作用未达到显著水平[24]. 综上所述,接种联合固氮菌剂后都有促进植物生长的趋势,并伴随有一定的增产效应,但这种增产效果不稳定,增产率在5%～30%之间.在中低肥力下,接种处理可提高产量5%～8%,但在高肥水平下接种增产效应不明显,或增产低于正常施肥接种.究其原因,主要是由于联合固氮菌与根系的联合只是松散的结合而没有形成稳定的共生结构,使得固氮效率易受外界环境的影响,导致了接种效果的不稳定.影响联合固氮菌接种效果的主要因素有: 1)土著微生物的竞争.大量研究表明,在自然条件下固氮菌很少能成为根际细菌菌群的优势部分,数量一般占总数的1%～10%,在有机质丰富的土壤中土著菌的数量高,会降低接种菌的定殖和竞争力,只有在氮素贫乏的土壤中才会表现出竞争的优势[7,36,56].一般认为,在新垦土壤上的接种效果好于熟化土壤.经基因工程改良的泌铵突变株、许多具专一性的内生固氮菌株也面临同样的问题[32]. 2)植物基因型差异和环境条件的变化.用15N稀释法和15N自然丰度法的研究结果表明,甘蔗能通过联合固氮固定相当一部分氮气,但固氮能力因植物基因型和环境条件的差异而高度可变.Shrestha,Ladha对70个不同水稻基因型研究发现,水稻的Ndfa值从0～20.2%不等[48].Urquiaga 等[53]指出,巴西甘蔗的生物固氮量也依赖于供水量及磷、钾和微量元素特别是钼的有效性. 3)结合态氮.结合态氮(氨、亚硝酸盐、硝酸盐等)会阻遏固氮酶的合成,抑制某些细菌固氮酶的活性,因此当氮源充足的情况下,联合固氮菌优先利用环境中的氮.一般土壤中结合态氮的浓度在5～500mg・kg-1下就能抑制或消除接种后土壤的固氮酶活性[56]. 4)氧.微生态环境中氧的水平是影响联合固氮菌的固氮效率一个重要因子,氧不可逆地使大多数固氮菌的固氮酶失活并调节固氮酶的合成,只有在低氧分压下固氮速率才达到最高水平.4　发掘和利用禾本科植物固氮潜力的研究方向411　联合固氮关系的强化和有效化是实现禾本科植物生物固氮的近期目标.首先必须获得广谱高效固氮菌株,可通过从自然界分离筛选或基因工程改良来实现.因地制宜,根据各地的土壤类型、气候条件、作物品种选用适宜的接种剂.其次,配合良好的田间管理措施,有报道指出玉米接种后应用地膜覆盖技术或在玉米的行间覆盖稻草可提高地温保持土壤湿度,有利于接种菌在根际的繁殖和定殖,而获得较好的接种效果[36,47].2561 应　用　生　态　学　报 15卷412　基因工程手段.1)应用基因工程构建耐铵、泌铵型联合固氮菌.至今已获得多个含抗铵阻遏基因nifA的耐铵固氮菌,如A1523、E2613、N G1390[37];含吸氢酶基因hup的高吸氢效率的工程菌;能将固定的铵分泌出菌体外的突变型泌铵固氮菌株,从接种效果来看,这类工程菌的促生作用好于野生型[36].但需进一步解决提高其与土壤微生物的竞争能力和保持高的固氮活性等问题.2)固氮基因向非豆科植物的转移.要使非豆科植物获得固氮能力,至少需要16个固氮基因的转移,而且需要解决固氮酶的氧敏感性,转移基因在真核生物中的表达调控等问题.这需要相当长时间的努力才能取得成功.413　诱导禾本科植物形成固氮根瘤.用纤维素酶、果胶酶降解根尖细胞壁[17]或用植物生长调节剂2,42二氯苯氧乙酸(2,42D)[46]处理根后能将根瘤菌、固氮螺菌引入小麦、水稻、玉米并形成类根瘤(Para2nodule)结构,在类根瘤中可以检测到大量细菌存在和较低的固氮酶活性.但目前对宿主植物如何接受结瘤信息、禾本科植物能否像豆科植物那样在适当的时间和空间内合成足够多血红蛋白保持类根瘤内氧平衡等问题尚未得以解决.414　植物内生固氮菌的发现为禾本科植物实现生物固氮开辟了一条新的途径.与其它根际联合固氮菌比较,内生固氮菌定殖于植物体内部,在木质部导管进行固氮作用.这个部位不仅可满足细菌生长和固氮所需的足够的能源、低氧分压以及交换代谢产物的微环境,还避免了化合态氮的抑制及土著微生物的竞争,固定的氮又可直接供给植物吸收,因而表现出更高的固氮效率[34,45,50].内生固氮菌主要靠传统的甘蔗栽培方法即种茎切段传播[20],也可通过刺食甘蔗叶片的粉虫传播[1],以及通过VA菌根真菌或含有内生菌的VA菌根菌孢子感染植物而引入植物体内[40].近年来应用VA菌根与内生固氮菌共接种甘蔗、高梁、甜菜已获得较大的成功,共接种的细菌降低了真菌在根中的定殖率,而真菌增加了细菌的感染率,也增加了植物的含氮量[30,41].这种固氮菌的接种方式不仅避免了基因工程方法的复杂性和不易实现性,又保证了联合固氮的高效性,无疑给禾本科植物的生物固氮带来了新的曙光.Reis等[44]最近通过调整甘蔗组织培养基成份,使醋酸固氮菌能单独在组培苗上接种成功.参考文献1　Ashbolt NJ and Inkerman PA.1990.Acetic acid bacterial biota of the pink sugar cane mealybug,S accharococcus 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E2mail:zjuzlm@4561 应　用　生　态　学　报 15卷。