生物工程中游技术实验--植物组织、器官培养的研究学校：学院：班级：姓名：学号：绿豆芽愈伤组织诱导培养实验【摘要】本实验以MS＋2,4-D为基本培养基,添加NAA或6-BA,对绿豆芽材料进行体外培养,诱导形成愈伤组织。

结果表明,在一定浓度范围内,NAA和6-BA对绿豆芽的诱导有促进作用。

不同激素组合培养下，绿豆芽外植体形成愈伤组织的类型不同,其色泽、细胞的形态结构显著不同。

其中，细胞分裂素和生长素的组合诱导芽及芽的增殖效果最好，MS+6-BA(6mg/L)+NAA(0.4mg/L)培养基最适。

【关键词】绿豆芽；组织培养；愈伤组织；6-BA；2,4-D；NAA;全能性一、前言细胞工程(Cell engineering) 是指应用现代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的理论与方法，按照人们的需要和设计，在细胞水平上的遗传操作，重组细胞的结构和内含物，以改变生物的结构和功能，即通过细胞融合、核质移植、染色体或基因移植以及组织和细胞培养等方法，快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。

其常用技术手段有植物组织培养，植物体细胞杂交、动物细胞培养、动物细胞融合、单克隆抗体、胚胎移植、核移植等。

根据细胞类型的不同，可以把细胞工程分为植物细胞工程和动物细胞工程两大类。

本文主要综述细胞工程中植物细胞工程的植物组织培养这一技术手段。

植物组织培养技术的应用范围包括快速繁殖、培育无病毒植物，通过大规模的植物细胞培养来生产药物、食品添加剂、香料、色素和杀虫剂等。

植物组织培养，诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。

在植物组织培养中，由于植物细胞具有全能性,即植物的体细胞具有母体植株全部遗传信息并会发育成为完整的个体。

因而,每一个植物细胞可以像胚胎细胞一样,经离体培养再生成植株。

随着细胞工程技术的不断发展,植物细胞和组织培养这一细胞工程技术也无例外地得到发展,目前已在许多植物上,特别是在农林生产实践中得到了广泛应用。

尤其在林木优良品种和无性系的快速繁殖方面进展较快。

统计资料显示,目前全世界已有6000多种植物细胞和组织培养成株。

实验证实,植物叶肉细胞、茎尖、根尖、花粉、胚、胚乳等细胞或组织均可以再生成植株。

本试验旨在利用NAA和6-BA的组合调控来诱导绿豆芽的愈伤组织，加深对植物外植体消毒、接种的无菌操作技术，学习外植体愈伤组织诱导的方法。

6-BA为细胞分裂素，主要作用是促进芽的形成,也可以诱导愈伤组织发生。

如果超过0.1毫克就会抑制发根，超过0.5毫克则完全不发根。

NAA是广谱型植物生长调节剂，能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根。

2,4-D是一种人工合成的植物生长激素。

二、材料与方法2.1 实验仪器、试剂和材料：2.1.1 器具超净工作台、光照培养箱、刻度烧杯（1000ml）、小烧杯若干、量筒（1000ml、50ml）、容量瓶（500mL 、250mL）、棕色试剂瓶（500mL、100mL）、药勺、玻棒、洗耳球、洗瓶、电炉、不锈钢镊子、剪刀、解剖刀、酒精灯、无菌吸水纸、一次性手套、记号笔、标签纸，滴管、电子天平（感量为0.0001g）、一般天平（感量为0.1g）、高压灭菌锅、pH计（pH试纸），三角烧瓶（100mL）、称量纸、数码相机等。

2.1.2 材料和培养基绿豆芽愈伤组织诱导培养基均为MS+2,4-D 1.0mg/L+(0~6mg/L)6-BA+(0~1mg/L) NAA （MS培养基配制见表1，激素配制见表2）。

诱导愈伤组织培养基均以MS培养基为基本培养基，根据处理不同，附加不同种类及浓度的植物生长调节物质(NAA、2,4-D、6-BA等)。

另加蔗糖30g/L，调节pH值为5.8左右，分装于三角瓶中，每瓶25ml，灭菌后冷却备用。

其植物生长调节剂配比如表3。

表1 MS培养基母液的配制表2 植物生长调节物质的配制表3 配制1000mL MS培养基成分的用量2.2 实验方法和步骤：2.2.1 愈伤组织培养2.2.1.1 准备工作接种前，用75%酒精棉球或20g/L新洁尔灭擦拭超净工作台台面，将培养基及接种用具放入超净工作台台面适当位置（培养基中的生长物质各浓度见表3），打开超净工作台紫外灯，照射20-30min后关闭，然后打开风机，约10min后，再开日光灯可进行无菌操作。

2.2.1.2 外植体表面消毒将绿豆芽在自来水下冲洗干净，用小刀切去外围组织，切成小段置于50 mL烧杯中，用75%酒精浸泡30 s后，立即除去乙醇。

移入含有1-2滴吐温20的0.1% HgCl2（或10％次氯酸钠）溶液中浸泡5 min，用无菌水洗3次，无菌纸吸干水分后，置于经灭菌处理过的垫有无菌纸的培养皿中。

使用镊子和解剖刀时，应先在酒精灯火焰上炽烧片刻，冷却后，再将绿豆芽切成约0.5 mm3的小块。

以上操作都要求在酒精灯火焰旁进行。

注意外植体切割时，动作要快，否则会造成失水而影响生长。

为防止操作时失水也可在培养皿中滴几滴无菌水，然后将无菌苗置于其中进行切割。

操作人员必需严格按无菌操作规则完成这些步骤，否则会造成外植体污染。

2.2.1.3 接种将切好的绿豆芽段接种至盛有培养基的果酱瓶中，每瓶接种2－3粒，快速封口，贴上标签，注明姓名、接种日期、培养基名称和培养材料名称。

整理、清洁超净工作台台面。

2.2.1.4 培养光照12h/d,光照度1500~2000LX，温度25±1℃。

大约15~25d后，果酱瓶中的外植体就可以胀大，形成愈伤组织。

经常观察外植体的生长变化或污染情况，并在培养一段时间后统计外植体的污染率以及愈伤组织的诱导率。

三、实验结果与分析3.1实验结果3.1.1愈伤组织诱导情况实验中，接入培养基中的136段绿豆芽，经6个星期连续培养、观察发现：总共接入外植体136个，在光照培养条件下，实际形成了58个愈伤组织。

表4 绿豆芽愈伤组织诱导情况统计表愈伤组织诱导率（%）= 实际形成愈伤组织/接种外植体数。

3.1.2部分实验图片愈伤组织生长良好，以下是部分的实验图片：第一周绿豆芽无明显变化3.2结果分析愈伤组织的形成是植物外植体材料、培养基成分和外界环境条件诸因素互相作用的复杂过程，可分为诱导、细胞分裂、细胞分化三个时期。

外植体的类型及其生理状态、接种时的放置方式等直接影响着愈伤组织的数量和质量。

外植体的幼嫩程度也影响着愈伤组织的再生能力。

培养基成分中，生长素和细胞分裂素对愈伤组织的诱导、增殖及其再生影响最大。

另外，不同培养阶段使用的配比也发生变化。

如诱导愈伤组织阶段可适当加大生长素的比例，由愈伤组织诱导芽时则需加大分裂素比例促进芽的分化。

外界环境条件的影响主要有光照、温度、湿度、培养基渗透压等。

第二周绿豆芽变透明，并且可见外植体有少许的增大 第三周绿豆芽明显膨胀，且少数绿豆芽变黄，开始形成愈伤组织。

第四周绿豆芽诱导形成愈伤组织，愈伤组织胀大，结构疏松，不均匀，为橙黄色。

实验表明，低浓度的BA(0~2mg/l)不能诱导芽的分化,随着6-BA浓度的升高,渐渐有厚而透明的芽出现。

就诱导芽产生及分化时,要求高水平的6-BA浓度,在实验中,6-BA浓度在6mg/l时达到了最好的效果。

NAA低浓度(0.1mg/l)的生长素有利于芽的分化;随着生长素浓度的增高,愈伤组织生长量也有所增加,但当培养基中含有5mg/LNAA时,则诱导形成根,芽的分化受到抑制。

这表明,在愈伤组织的形成过程中,生长素起着决定性作用,而在芽分化过程中,细胞分裂素起着重要的作用。

因此,在愈伤组织的诱导和芽分化过程中,选用合适的细胞分裂素与生长素的组合,并控制其比例是十分重要的。

本次诱导愈伤组织形成实验中，有部分材料污染，但愈伤组织的诱导率较高。

总结原因可能有以下几点：本次实验愈伤组织诱导有小部分被污染，其中污染的可能原因是：无菌室清洁度不够；接种时绿豆芽组织暴露时间过长。

另外，也有可能是操作者本身没进行消毒，在实验过程中碰触到绿豆芽段。

四、实验小结植物的器官组织与完整植株分离后，如果供给合适的营养和生长调节物质即适宜的生长环境，它们在离体条件下由于受到伤害的刺激以及生长调节物质的诱导，可恢复细胞分裂和生长分化的能力。

因此植物的离体组织、器官、细胞或原生质体在无菌和适宜的人工培养条件下培养，能够产生愈伤组织，并长成为一株完整植物体。

激素是培养基中诱导芽分化的关键物质,对植物组织培养的成败起着决定性的作用。

在本实验中绿豆芽外植体通过一个高水平的细胞分裂素(6-BA6mg/l)和一个低水平的生长素(IAA0.4mg/l)的组合诱导形成芽,这与茎尖外植体培养的结果一致。

植物不同的器官和组织，对离体培养的反映是不同的，其形态发生的能力也是不同的。

外植体的种类是影响组织培养效果的主要因素之一。

即使是相同的器官，由于其生理学或发育年龄的差异，也会影响形态发生的类型及方式。

外植体的年龄对组织的再生能力有很大的影响，越幼嫩就越容易获得再生植株。

外植体的选择和处理对褐变有较大影响，幼龄材料酚类化合物含量少,而成龄材料比较多。

植物组织培养的成功与否决定于外植体的制备、无菌操作和人工培养环境。

外植体的制备是能否建成离体繁殖系要过的第一关。

制备外植体的原则是无菌和有活性，无菌是外植体植被的要求，有杂菌带入培养基会造成微生物污染，而阻滞甚至杀死外植体。

有活性是外植体制备的前提，无活性的外植体的培养在植物组织培养中是无意义的。

无菌操作是贯穿于整个组织培养过程的一门关键技术，甚至可以说组织培养的前提就是无菌。

事实上外植体的制备过程就是无菌处理过程，而其后的一系列操作都是在无菌环境下进行的，实验室中经常使用的无菌操作设备是超净工作台。

无菌操作者的操作手法和习惯也是无菌操作成功与否的关键，通常进行无菌操作的实验人员也要经过严密的无菌操作训练并建立严格的“无菌概念”。

能否把植物组织培养做到满意的人工调控，关键在于人工培养环境。

人工培养环境是整个组织培养的难点和重点，也是近百年来植物生理学家一直探讨和研究的重要话题。

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