无菌操作流程
（1）在接种3天前用甲醛熏蒸接种室，并于接种前3小时打开其内紫外线灯进行杀菌；
（2）在接种前20分钟，打开超净工作台的风机以及台上的紫外线灯；
（3）接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等；
（4）上工作台后，用酒精棉球搽拭双手，特别是指甲处。然后搽拭工作台面；
（5）先用酒精棉球搽拭接种工具，再将镊子和剪刀从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干；
（21．4 mg/L）
223mg
②
ZnSO4·7H2O
8．6 mg/L
86mg
③
CoCl2·6H2O
0．025mg/L
0．25mg
④
CuSO4·5H2O
0．025 mg/L
0．25mg
⑤
Na2MoO4·2H2O
0．25 mg/L
2．5mg
⑥
KI
0．83 mg/L
8．3 mg
⑦
H3BO3
6．2 mg/L
菌包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。
无菌的区域：经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，经其他物理的或化学的灭菌方法处理后的物体(当然这些方法必须已经证明是有效的)，高层大气、岩石内部、健康的动、植物的不与外部接触的组织内部，强酸强碱，化学元素灭菌剂等表面和内部等等都是无菌的。
灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的微生物全部杀死。
化学药品
1升量
母液（100ml）
Na2·EDTA
37．3 mg/L
373 mg
FeSO4·7H2O
27．8 mg/L
278 mg
4、MS有机物母液（100X）
称10升量溶解在100ml蒸馏水中。配1升培养基母液10ml。
化学药品
1升量
母液（100ml）
①
烟酸
0．5 mg/L
5 mg
②
盐酸吡哆素（VB6）
签名：年月日
③
CaCl2·2H2O
440 mg/L
4．4g
④
MgSO4·7H2O
370 mg/L
3．7g
⑤
KH2PO4
170 mg/L
1．7g
2. MS微量元素母液（100X）
称10升量溶解在100ml蒸馏水中。配1升培养基母液10ml。
化学药品
工作液
母液（1L）
①
MnSO4·4H2O
（MnSO4·H2O）
22．3 mg/L
诱导愈伤组织的关键主要是培养条件，其中激素的成分和浓度是最重要的因素。
(5)从外植体脱分化形成愈伤组织大致可分为三个时期:诱导期、分裂期、分化期
诱导期
细胞准备进行分裂的时期，是愈伤组织形成的起点。
细胞内发生的变化：
气体交换增加，如氧气的吸收增加
RNA含量增加（增加到300%）
蛋白质量增加（每个细胞的总增加量为200%）
接种台擦拭消毒：75%酒精。
4、实验服、口罩、滤纸灭菌
湿热灭菌：121℃,20-30min
紫外线灭菌。
实验服灭菌后置于缓冲间或密封好。
5、物体表面用药剂喷雾/擦拭灭菌
灭菌方式：喷雾、涂抹、擦拭杀菌
范围：桌面、墙面、双手、材料表面
消毒剂：70%酒精；1-2%来苏水；0.25-1%新洁尔灭；洗衣粉；吐温-80
4、实验方法、步骤、现象及注意事项：
实验方法及步骤
一、MS培养基母液的配制和保存
（一）MS培养基母液的配制
1、MS大量元素母液（10X）
称10升量溶解在1升蒸馏水中。配1升培养基取100ml。
化学药品
工作液（1升）
母液（1升）
①
NH4NO3
1650 mg/L
16．5g
②
KNO3
1900 mg/L
19．0g
酶活性增强
分裂期
指外植体细胞经诱导脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程。
细胞的主要表现：
细胞的数目迅速增加；每个细胞平均鲜重下降。；细胞体积小，内无液泡。
细胞的核和核仁增大到最大。
细胞中RNA含量减少，而DNA含量保持不变。
随着细胞不断分裂和生长，细胞总干重、蛋白质和核酸量大大增加，新细胞壁合成极快。
消毒：指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用。
显然经过消毒，许多细菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不会完全杀死，即由于在消毒后的环境里和物品上还有活着的微生物，所以通过严格灭菌的操作空间(接种室、超净台、等)和使用的器皿，以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。
在这样的条件下进行的操作，就叫做无菌操作。
培养条件：全黑暗一周转至新培养基25℃，弱光照
再次转接
5、实验结果分析与讨论：
经过多次培养，我们的试管苗长势良好，
6、参考文献：
（1）植物组织培养教程，李俊明、朱登元，中国农业大学出版社，2005.9
（2）植物组织和细胞培养，中国科学院上海植物生理研究所细胞室，上海科学技术出版社
7、实验总结
8、教师评语及评分：
（6）接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；
（7）接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外线灯灭菌30分钟，若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。
（二）接种
一般步骤：酒精擦拭手、器械消毒、酒精灼烧、酒精擦拭培养皿、接种、塞回瓶塞
四、愈伤组织诱导
（一）诱导培养基准备
1.植物生长调节物质母液配制
（3）常用的灭菌方法
物理方法如干热(烘烧和灼烧)、湿热(常压或高压蒸煮)、射线处理(紫外线、超声波、微波)、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施；
化学方法使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要根据工作中的不伺材料不同目的适当选用。
a、培养基用湿热灭菌——高压蒸汽灭菌
本科学生综合性
实验报告
姓名：学号：
学院：专业、班级：
实验课程植物生物工程实验
指导教师及职称
开课学期至学年学期
云南师范大学教务处编印
实验序号及名称：综合实验一植物愈伤组织培养及其应用
实验时间：
2013年
实验室：
睿智3栋428
1、实验目的：
（1）掌握培养基母液配制方法
（2）掌握培养基配制方法
（3）熟悉无菌材料继代、繁殖操作
b、用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌（95%的酒精，酒精灯火焰上灼烧）
c、玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌（烘箱加热到160-180℃持续90分钟）
d、不耐热的物质采用过滤灭菌（一些生长调节剂如赤霉素、玉米素、脱落酸和一些化学成分在高温高压下会发生降解而失去效能或降低效能）
e、空间采用紫外线和熏蒸灭菌（紫外线灭菌与熏蒸灭菌）
（2）试剂
95%酒精，1N NaOH，1N HCl，硝酸铵，硝酸钾，氯化钙，磷酸二氢钾，硫酸镁，硫酸锰，硫酸锌，氯化钴，硫酸铜，钼酸钠，碘化钾，硼酸，Na2EDTA，硫酸亚铁，盐酸，盐酸吡哆素（VB6），盐酸硫胺素（VB1），肌醇，甘氨酸，蒸馏水、琼脂、蔗糖等。
3、实验原理：
植物组织培养是指植物的任何器官、组织或细胞，在人工预知的控制条件下，放在含有营养物质和植物生长调节物质等组成的培养基中，使其生长、分化并形成完整植株的过程。其理论依据是植物细胞具有全能性。
用前湿热灭菌：121℃, 20-30min
接种前用酒精棉球擦试，浸入75%酒精液中，并在酒精灯火焰上灼烧灭菌
2、玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌
干热灭菌：烘箱加热到160-180℃,1.5-2.0h
湿热灭菌：121℃, 20-40min
接种前用酒精棉球擦试，并在酒精灯火焰上灼烧灭菌。
3、空间采用紫外线紫外灯照射(接种室、超净台、接种箱)：波长260nm，距离小于1.2m，20-30min。
NAA：热水或少量95％的酒精→加水定容；
BA：少量1mol的HCI中→加水定容；
注意：配制好的母液瓶上应分别贴上标签，注明母液名称、浓度及单位、日期。
2.培养基准备
MS+NAA 2mg/L+BA 0.5mg/L
MS培养基成分同前
加入激素母液
配制、分装、灭菌过程同前
3.接种及继代
材料：马铃薯试管苗茎段
（1）母液
在植物组织培养工作中，通常先配制一系列母液，即贮备液。所谓母液是欲配制液的浓缩液，这样不但可以保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取，而且还便于低温保藏。
（2）灭菌
有菌的区域是：凡是暴露在空气中的物体，接触自然水源的物体，至少它的表面都是有菌的。因此，无菌室未处理的地方、超净台表面、简单煮沸的培养基、我们使用的刀、剪在未处理之前、我们身体的整个外表及与外界相连的内表，呼出的气体、培养容器无论洗得多干净等等都是有菌的。
0．5 mg/L
5 mg
③
盐酸硫胺素（VB1）
0.1 mg/L
1 mg
④
肌醇
100 mg/L
1 g
⑤
甘氨酸
2 mg/L
20 mg
注意：配制时，两种成分分别溶解在少量蒸馏水中，其中EDTA盐较难完全溶解，可适当加热。混合时，先取一种置容量瓶（烧杯）中，然后将另一种成分逐加逐剧烈震荡，至产生深黄色溶液，最后定容，保存在棕色试剂瓶中。
分化期
指愈伤组织细胞停止分裂，细胞内发生一系列形态和生理上的变化,形成一些不同形态和功能的细胞的时期。
细胞特点：
A细胞分裂部位和方向发生改变：
B形成瘤状或片状的分生组织结节。或维管组织结节。
C细胞的体积相对稳定，不再减少。
D出现了各种类型的细胞：如管胞、纤维细胞、薄壁细胞、分生细胞、色素细胞等。
E生长旺盛的愈伤组织呈乳白色、白色或浅绿色，老化的多转化为黄色或褐色。