冠状病毒感染——“非典” X线胸部检查可见肺部不同程度的片状阴影，少 数病人进展迅速，呈大片状阴影，大多数为 双侧改变，阴影吸收消散较慢。
病毒检测
TMV transmission by an Apis sp.
A severe mosaic symptom on tomato leaf (TMV)
腿色斑Chlorotic spoting
黄化Yellowing
二、病毒的分离与鉴定
提纯extraction/纯化purification
病毒的分离与鉴定
标本采集 标本处理后接种
动物接种 观察发病
组织培养
CPE EM
包涵体 空斑试验 红细胞吸附 中和试验
鸡胚接种
卵黄囊膜 尿囊液 羊膜腔液 绒毛尿囊膜 观察囊膜病变 血凝试验 血凝抑制试验
（三）病毒提纯的技术
1、差速离心和密度梯度离心
二、病毒的分离与培养
• 差速离心：交替使用高速和低速离心
高速离心（40000~80000g）使病毒沉淀，取沉淀 低速离心（约4000g）仅去除大的细胞碎片等杂质，取上清
• 密度梯度离心：部分或完全根据颗粒在一个无对 流介质中的密度而获得分离 蔗糖10%~40% CsCl等
7、柱层析法
吸 附：用离子交换或吸附法
分子筛：琼脂糖或葡聚糖制成凝胶柱
8、抗血清处理
针对宿主蛋白的血清来沉淀杂蛋白 加病毒的抗血清形成病毒—抗体复合物
二、病毒的分离
要证明某种疾病是某一感染因子所引起．则必须满 足Rivers法则： ① 从患病者体内分离出病毒； ② 在实验动物或寄主细胞中可以培养；
（三）病毒提纯的技术
2、沉淀法 盐析法 等电点沉淀 丙酮沉淀 聚乙二醇沉淀 乙醇沉淀 3、吸附法
二、病毒的分离与培养
简便快速但粗糙易变性
硫酸铵浓度达30~50%饱和度时多数病毒沉淀 加醋酸或盐酸 浓度达40~70% 浓度达4~8% 浓度达20% 沉淀植物蛋白，上清夜用硫酸
铵沉淀
磷酸钙、离子交换树脂、羧甲基纤维素
病毒学研究的主要方法
• 生物学特性测定:在宿主上的反应——症状、传播等 • 病毒分离与培养：提纯与纯化、二元培养法 • 光镜与电镜观察：病毒粒子和病毒与相应抗血
清的特异免疫吸附情况
• 免疫学技术：以血清学和组织免疫化学方法检测
带毒情况、多克隆抗体、单克隆抗体
• 分子生物学技术：核酸分子杂交、PCR等
③ 证明这种培养物具有滤过性；
④ 在原始宿主或相关种内能产生同样的病症；
⑤ 能重新分离出病毒。
• 病毒的分离与鉴定组成了病毒学诊断技术的主体。 • 病毒分离(virus isolation)是诊断病毒感染的“金标 准”(goldstandard)。
病毒的分离
• 组织培养 • 鸡胚培养 • 动物接种
4、酶处理
许多病毒抗蛋白酶和核酸酶
二、病毒的分离与培养
（三）病毒提纯的技术
5、有机溶剂萃取 有机溶剂可溶掉脂肪、有色杂质或非病毒的变 性蛋白，如脊髓灰质炎病毒提纯中用正丁醇：
脂肪 醇
变性非病毒蛋白
水 病毒
要考虑病毒对有机溶剂的耐受性
二、病毒的分离与培养
（三）病毒提纯的技术
6、电泳法
普通电泳、密度梯度电泳、等电聚焦电泳等
三、病毒的电镜观察法
1、正染法（超薄切片法、病组织）
– – 将细胞用戊二醛固定，然后脱水、包埋、切片、染色、观察病毒颗粒， 通常1~2 d完成。 操作复杂、费时，但样品可长期保存，可观察病毒粒子形态与发生过 程。 直接将病毒悬液(也可用细胞)滴在铜网上，用重金属(通常用磷钨酸) 进行染色，观察病毒颗粒，10-20min可出结果。 原理：负性染料不渗入病毒颗粒，而是将病毒颗粒包绕，由于负性染 料含重金属使电子束不能穿透，病毒颗粒具有亮度，在周围暗背景上 显示亮区——较正染法显示的图像清晰，可显示病毒的结构。 缺点：敏感性低，要求病毒量在107／mL以上，同科病毒难于鉴别。
2、负染法
– –
–
3、投影技术 4、胶体金标记技术、与免疫学技术结合等
采用几种电镜技术观 察病毒粒子的形态
负染技术
Orf virus：口疮病毒(接触性脓疱皮炎 )
Vaccinia virus 痘苗病毒 （投影技术）
Ebola virus埃博拉病毒（正染技术）
美国疾病控制和预防中心公布的一张未标明日期的彩 色电子显微照片。它显示出H5N1型禽流感病毒（金 黄色）在MDCK细胞（绿色）培养液中的活动状态
生殖道HSV-2涂片 DFA染色阳性
五、分子生物学技术
• 聚合酶链反应（PCR） • 核酸分子杂交 ：Southern blot、Nouthern blot和Westhern blot • 蛋白质组学 • 基因组学：核酸序列测定及基因功能 • 基因工程 ：抗病毒疫苗或抗病毒的大分子 多肽 、病毒载体
绒毛尿囊膜痘病毒特异性损伤
3. 动物接种
• 常用动物 小鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、猴等。 不同病毒对动物的敏感性不同，根据病毒种类 加以选择。 • 接种途径 按病毒侵袭部位选择相应的接种途径： – 乙型脑炎病毒及狂犬病毒 小鼠脑内接种 – 柯萨奇病毒 乳鼠腹腔接种 – 乙肝病毒 黑猩猩静脉注射 – 流感病毒 鼻腔滴种 • 用途 分离鉴定病毒，制备疫苗，制备抗血清
• 1953年，斯坦利第一次提取并结晶了 TMV，这是病毒学史上一个重要的里程 碑。
二、病毒的分离与培养
（一）病毒的纯化与提纯
一般纯化方法
• 动物病毒的纯化：从空斑、病斑分离，用终点稀释法
• 植物病毒的纯化：
如确定是一种病毒，且可机械摩擦接种，则 接种到适当寄主上； 如可能有多种病毒，则要嫁接传染，先将病 毒保存，然后试用虫媒或其他方法分离。
一、生物学特性测定
• 在宿主上的反应
宿主范围、症状表现、传播方式等
• 病毒的理化性质
病毒粒子的形态、大小、对理化因子的耐受性、 体外存活期等
• 病毒接种方法
注射接种、病毒组织培养技术 植物病毒——汁液摩擦接种、昆虫介体接种、嫁 接接种、菟丝子接种法等
巨细胞病毒感染细胞的典型“猫头鹰眼”样核内包涵 体
三、病毒的光镜与电镜观察法
光 镜：宿主组织切片、包涵体
标本制备
浓缩标本有以下几种方法：
① 超速离心 离心的时间和速度取决于病毒颗粒的大小和离心 机转头的半径，一般是30min到3h．沉淀的样本用灭菌蒸 馏水洗后再放到铜网上； ② 超过滤法 用于分子筛的蛋白质相对分子质量为10000；
③ 接种细胞 接种细胞增殖病毒，然后快速包埋、切片； ④ 免疫凝集 如有特异抗血清，且病毒已知，也可用该法浓缩 病毒
抗原检测 抗体检测 病理检查
病毒的提纯是将宿主中的病毒粒子与宿 主细胞组分区分开来的过程。 原理是利用病毒的蛋白质和大分子粒体 的特性，及其与宿主细胞组分在理化特性上 的差异将病毒粒子区分出来，并尽可能保持 侵染力。 目的是确切地研究病毒理化、生物学特 性、化学组分、组成、增殖过程及机制，还 可用于制备高效价的抗血清。
1、病毒抗原 2、病毒抗体
3、免疫学诊断方法
免疫荧光法(IF) 免疫酶法（ELISA） 单克隆抗体技术
血凝抑制（HI）试验 血凝试验HA 琼脂扩散试验
五、病毒抗原检查
• 可检测细胞内、外的游离病毒抗原。 • 敏感、特异，简便、快速。适用于多种病毒性 疾病的早期快速诊断。
Influenzavirus A培养 物DFA染色阳性
羊膜腔：用12~14d鸡胚，将检材注入羊膜腔，孵育后取羊
水检查。常用于流感病毒的初次分离
尿囊腔：用9~12d鸡胚，将标本接种于尿囊腔，孵育后取
尿囊液检查。常用于培养流感病毒和腮腺炎病毒等
绒毛尿囊膜：用10~12d鸡胚，无菌下开一小窗，将材料
滴在绒毛尿囊膜上，孵育后观察膜上有无斑点病变。常用
于培养单纯疱疹病毒，天花病毒和痘病毒
病毒学研究方法简介
生物安全实验室
根据微生物及其毒素的危害程度不同，分为４级， 一级最低，四级最高。
• P1实验室——研究的病毒危险性较低，试验人员连口罩都不用
带，穿上白大褂就可以了，试验人员在这里很放松； • P2实验室——研究的是中度危险的病原，像肝炎、流行性感冒 等等，要求戴防护性较好的口罩； • P3实验室——研究的是高度危险的病毒，传染性很强，而且没 有疫苗，试验人员的保护措施要比P1/P2实验室严密得多； • P4实验室——全球级别最高的生物安全实验室，研究的是极度 危险的病毒，如令人谈之色变的埃博拉病毒、马尔堡病毒，进入 这种实验室的工作人员，处于防护服的严密保护之下，连空气都 不能在实验室内呼吸，红色螺旋状管子，是专门用来向室内输送 新鲜空气的，试验人员一进入实验室，要先屏住呼吸，马上接上 这种管子，然后才能呼吸。
二、病毒的分离与培养
组织培养： 原代细胞：新鲜组织+胰蛋白酶消化，分散+培养液
成——单层细胞
二倍体细胞株：原代细胞传代（为二倍体细胞） 传代细胞系：肿瘤组织或二倍体细胞自发转化（非整倍体）
鸡胚接种
卵黄囊接种：用5~8d鸡胚，以细长针由气室端刺入卵黄
囊，孵育后收集卵黄囊膜检查。常用于一些嗜神经病毒
Hale Waihona Puke 电镜技术的应用• 研究病毒形态、鉴定
观察病毒的形态及形态发生学过程；亚显微结构； 病毒与宿主细胞的关系；病毒感染细胞的超微结构 改变；病毒的分类等。
• 诊断病毒病
检测不能在体外培养的病毒，如轮状病毒、星状病 毒、嵌杯病毒、HAV等都是用电镜最先发现的——能 进一步发现新的病毒和病毒病。
四、免疫学技术