中性盐的亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水区暴露， 由于疏水区的相互作用导致沉淀；
常用的盐析剂
硫酸铵：
优点:价廉；溶解度大（767g/L）；稳定蛋白 质；
缺点：水解变酸；高pH 释氨，腐蚀；残留产 品有影响。
硫酸钠 硫酸镁 磷酸二氢钠 柠檬酸盐
选用盐析用盐的几点考虑
盐析作用要强 盐析用盐需有较大的溶解度 盐析用盐必须是惰性的 来源丰富、经济
3. 球蛋白的分离： 新离心管称重并记录，量取10mL上清液体积，将其置于另一离
心管中，用移液器滴加饱和硫酸铵溶液，使溶液的饱和度达到50%， 4℃放置15min，3000r/min离心10min，其上清液为清蛋白，沉淀 为球蛋白。弃去上清液（直接倒掉上清液，并倒扣在滤纸上），留下 沉淀部分。 +6mL饱和硫酸铵溶液 4. IgG的分离：
定的胶体溶液。
⑵蛋白质分子间静电排斥作用（存在双电层）
因此，可通过降低??? 降低蛋白质溶液的稳 定性，实现蛋白质的 沉淀。
主要内容
3.1 盐析法 3.2 有机溶剂沉淀法 3.3 其它沉淀技术
3.1 盐析法
概念：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质
（酶）等生大分子物质在水溶液中的溶解 度降低，产生沉淀的过程。
IgG相对分子质量为15-16万，沉淀系数约为7S
。
IgG是血清主要的抗体成分，约占血清Ig的75%
。其中40～50％分布于血清中，其余分布在组 织中。
粗分离 纯化 鉴定
IgG结构图
四、操作步骤与方法
1、计算各步滴加饱和硫酸铵溶液的量 2、清蛋白和球蛋白的分离：
离心管加入5mL血浆和5mL 0.01mol/L,pH7.0的磷酸 盐缓冲液，混匀，边加饱和硫酸铵溶液边搅拌，使溶液最终饱 和度为20%，4℃放置15min，3000r/min离心10min，弃 去沉淀（沉淀为纤维蛋白原），其上清液为清蛋白和球蛋白。 +2.5mL饱和硫酸铵溶液 边滴加搅拌，防止局部过饱和的现象，达不到预期的饱和度。 搅拌时不要过急以免产生过多泡沫，致使蛋白质变性。
第三章 沉淀技术
沉淀法概述
利用沉淀剂使所需提取的生化物质或杂质在
溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀 的过程。
特点：操作简单、经济、浓缩倍数高 种类：盐析、有机溶剂沉析、等电点沉析等 缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选
择性不强
蛋白质胶体溶液的稳定性
⑴蛋白质周围的水化层可以使蛋白质形成稳
影响盐析的因素
盐饱和度的影响： 样品浓度的影响：
蛋白质浓度大，盐的用量小，但共沉作用明显，分辨率 低；
蛋白质浓度小，盐的用量大，分辨率高；
pH值：影响蛋白质表面净电荷的数量
通常调整体系pH值，使其在pI附近；
盐析温度：
一般在高盐浓度下，温度升高，其溶解度反而下降
盐析操作
硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂 采用硫酸铵进行盐析时可按二种方式加入：
一般利用离子交换层析法纯化。在离子交换层析
之前，由于盐析所得的蛋白质中含有大量硫酸铵 ，将影响离子交换层析。
所以，在层析之前需要“脱盐”。“脱盐”有凝
胶过滤法和透析法。
实操：盐析法分离血清IgG
IgG是免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)的
缩写。根据结构的不同将免疫球蛋白分为五种 ，IgG是人的免疫球蛋白之一，其他还有lgA、 lgM、IgD和lgE。
G和A为常数，数值与温度有关。
现在已将达到各种饱和度所需固体硫酸铵的数量列 成表，使用时不需计算可直接从表中查出。
注意事项
市售固体硫酸铵中一般残留有硫酸，所以制备的
饱和硫酸铵溶液的PH常在4.5 ~5.5之间，作用之 前应该用氢氧化铵调节，使其PH为7；
用固体硫酸铵盐析时，蛋白质应溶解于具有一定
缓冲能力的溶液中；
在硫酸铵中还含有一些重金属离子，用量过大时
易使蛋白质变性，在这种情况下可加入一些EDTA 等螯合剂以螯合这些金属离子。
注意事项
硫酸铵盐析法可使蛋白质的纯度提高约5倍，而且
可以除去DNA，RNA等。
但盐析后的蛋白质中仍含有一些杂蛋白，所以盐
析产生的产品为粗分离产品需要进一步纯化。
①直接加入固体(NH4)2SO4粉末，工业上常采用这种方 法，加入速度不能太快，应分批加入，并充分搅拌，使 其完全溶解和防止局部浓度过高；
②是加入硫酸铵饱和溶液，在实验室和小规模生产中， 或(NH4)2SO4浓度不需太高时，可采用这种方式，它可 防止溶液局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。
脱盐
积并不等于混合前两种溶液体积之和，而上 式中是按相等于计算的，所以会产生误差。
但实验证明所造成的误差一般小于20%，
故可忽略不计。
2．固体硫酸铵法
X = G(C 2 − C1 ) 或X = G(C2 − C1 )
100 − AC2
1 − AC2
X是将1L饱和度为C1溶液提高到饱和度为C2时，需
要加入固体硫酸铵的重量（g）。
V
=
V0
C2 100
− −
C1 C2
或V
=
V0
C2 − C1 1− C2
式中: V0——蛋白质溶液的原始体积； C2——所要达到硫酸铵饱和度； C1——原来溶液的硫酸铵饱和度； V——应加入饱和硫酸铵溶液的体积。
将计算所得体积的饱和硫酸铵溶液加入到混
合蛋白质溶液中，即可达到盐析的目的。
严格讲，混合两不同溶液时，混合后的总体
透析和凝胶过滤
举例：硫酸铵分级盐析蛋白质
用硫酸铵分级盐析蛋白质时，盐析出某种蛋
白质成分所需的硫酸铵浓度一般以饱和度来 表示。
实际工作中将饱和硫酸铵溶液的饱和度定为
100%或1。
盐析某种蛋白质成分所需的硫酸铵数量折算
成100%或1饱和度的百分之几，即为该蛋白 盐析的饱和度。
1．饱和硫酸铵溶液法
将所得的沉淀溶于5mL 0.01mol/L,pH7.0的磷酸盐缓冲溶液中， 滴加饱和硫酸铵溶液，使溶液的饱和度达35%，在4℃放置20min， 3000r/min离心15min。其上清液为α、β球蛋白，沉淀为IgG。弃去 上清液，即获得粗制的IgG沉淀。 +2.7mL饱和硫酸铵溶液
盐析法的原理
（1）破坏水化膜 （2）中和电荷
盐析法原理
当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两
种情况：
（1）“盐溶”现象—低盐浓度下，蛋白质溶解度增 大
（2）“盐析”现象—高盐浓度下，蛋白质溶解度随 之下降，原因如下：
无机离子与蛋白质表面电荷中和，形成离子对，部分中 和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间的排斥力减弱， 从而能够相互靠拢；