② 同序异切酶 KpnⅠ 和 Acc65Ⅰ 识别的序列是 相同的，但它们的切割位点不同，分别为 GGTAC↓C 和 G↓GTACC 。 ③“同功多位”许多识别简并序列的限制酶包含 了另一种限制酶的功能。如 EcoRⅠ 识别和切割位点 为 G↓AATTC ， ApoⅠ 识别和切割位点为 R↓AATTY ，后者可识别前者的序列。 ④ 其它有些限制酶识别的序列有交叉，如在 pUC 系列质粒的多克隆位点中有一个 SalⅠ 位点（识别 切割位点为 G↓TCGAC），该位点也可被 AccⅠ（识 别切割位点为 GT↓MKAC）和 HincⅡ（识别切割位点 为 GTY↓RAC）切割。
1.4 限制性核酸内切酶活性及其影响因素
1.1 引言--核酸酶和限制性核酸内切酶的定义
核酸酶（Nuclease）： 通过切割相邻两个核苷酸残基之间磷酸二酯键，导致 核酸分子多核苷酸链水解断裂的蛋白酶。 1）按作用对象可分为: Deoxyribonuclease (DNAase) & Ribonuclease (RNAase) 2）按水解断裂核酸分子不同方式可分为： Endonuclease & Exonuclease
PstⅠ切割后产生3ˊ粘性末端：
有一些酶沿对称轴切断DNA，产生平 端或钝端（Blunt end）, 如SmaⅠ：
Recognition Sequences and Cutting sites of selected Restriction Endonucleases
Enzyme Recognition sequence BamH I G↓GATCC Enzyme Recognition seuqence Pst I CTGCA ↓G
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OH
P
5` 3`
3` 5`
DNA ligase
5` 3` 3` 5`
DNA ligase 连接缺刻(nick)
DNA连接酶
连接的部位：磷酸二酯键（梯子的扶手）， 不是氢键（梯子的踏板）。
2.2 种类及作用机理
T4 DNA连接酶(ATP提供能量）和 大肠杆菌DNA连接酶（NAD+提供能量） 两种。
大肠杆菌的DNA连接酶
大肠杆菌的DNA连接酶是一条分子量为75KD的多 肽链。对胰蛋白酶敏感，可被其水解。水解后形成 的小片段仍具有部份活性，可以催化酶与NAD(而不 是ATP)反应形成酶-AMP中间物，但不能继续将AMP 转移到DNA上促进磷酸二酯键的形成。
大肠杆菌的DNA连接酶
DNA连接酶在大肠杆菌细胞中约有300个分子， 和DNA聚合酶Ⅰ的分子数相近，这也是比较合理的 现象。因为DNA连接酶的主要功能就是在DNA聚合酶 Ⅰ催化聚合,填满双链DNA上的单链间隙后,封闭DNA 双链上的缺口。这在DNA复制、修复和重组中起着 重要的作用，连接酶有缺陷的突变株不能进行 DNA 复制、修复和重组。
Bgl II EcoR I
Hind II Hind III Kpn I Not I
A ↓GATCT G ↓AATTC
GTPy ↓PuAC A ↓AGCTT GGTAC ↓C GC ↓GGCCGC
Sal I Sau3A I
Sfi I Sma I Xba I Xho I
G ↓TCGAC ↓GATC
GGCCNNNN ↓NGGCC CCC ↓GGG T ↓CTAGA C ↓TCGAG
1μg DNA /1U HPaⅠ 50μl
37℃
1h
限制性核酸内切酶的反应条件
2) 反应系统因素
缓冲液（无菌、无污染） buffer （pH=8.0） ：
50mmol/L Tris-HCl 10mmol/L MgCl2 1mmol/L DTT或巯基乙醇 100μg BSA/ml （DDT：二硫苏糖醇 BSA：牛血清蛋白) NaCL（0, 500, 1000mM）
双酶切
A有公用Buffer的。（直接用公用Buffer 切）
B两种酶反应温度不同的。（先切其中 一个然后高温失活，再用另外一个酶切） C无公用Buffer的：先用低盐Buffer切几 个小时，再补加盐分到高盐加入另外一 个酶继续切
限制性核酸内切酶的反应条件
3.星活性
在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列， 这个改变的特殊性称星星活性,如EcoRⅠ星活性用EcoRⅠ*表
在指明pH与37℃，在0.05mL反应混合
物中，1小时消化1μg的λDNA的酶量为1
单位。
(3)限制性核酸内切酶的反应条件
1)底物 DNA
DNA纯度:
RNA 与 E 结合影响有效酶浓度； DNA浓度: [DNA]过大，抑制酶活，影响酶分子扩散 如：4μg DNA /1U HPaⅠ 50μl 37℃ 15h
多核苷酸5`-OH磷酸化，制末端标记探针
末端转移酶
S1核酸酶 DNA酶Ⅰ RNA酶A 逆转录酶 磷酸酶
使3`-末端加同聚物尾
降解单链DNA或RNA 在双链DNA上产生随机切口 降解RNA 补平反应，合成cDNA或制探针 切除核酸末端磷酸基
1 限制性内切酶
1.1 引言--核酸酶和限制性核酸内切酶的定义 1.2 限制性核酸内切酶的命名 1.3 限制性核酸内切酶的分类
酶 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 大肠杆菌DNA聚合 酶Ⅰ 或Klenow酶
SUMMARY 主要用途 识别DNA特定序列，切割DNA分子 连接两个DNA分子或片段 1 制作DNA探针；2 合成cDNA第二链； 3 填补双链DNA 3`凹端；4 DNA测序。
Taq DNA 聚合酶
多核苷酸激酶
聚合酶链式反应及功能 2.2 种类及作用机理 2.3 使用时的注意事项
2.1 定义及功能
DNA连接酶（DNA ligase）：可使一段DNA的 3` 羟基末端和5`磷酸末端形成3`，5`- 磷酸二酯 键，把两个DNA片段连在一起，封闭DNA双链上形 成的切口的酶。 DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现 的。 J:\生物视频\细胞生物学视频\连接酶\DNA连接酶.
功能：限制、修饰
特点：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸为辅 助因子；识别位点和切割位点不一致， 没有固定切割位点（随机性）；
应用：不常用。
功能：限制、修饰
1.3.2 Ⅲ型限制性内切 酶
特点：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸为辅助因 子；特异切割，切割位点在识别位点 外，距识别位点3`端24-26bp处。 应用：数量很少，分子克隆中无实际作用。
示。
影响因素：甘油浓度高（>5%），酶过量（>100U/ml）， 离子强度低（<25mM）， pH 值过高（>8.0）， 45%聚乙二 醇(PEG)，有机溶剂，8%二甲基亚枫，二价阳离子， 12%乙醇。
DNA末段的长度对限制酶切割 的影响
需要在识别序列两端存在一定长 度的非识别序列增加切割效率
位点偏爱（Site preference）
限制性内切核酸酶（restriction endonuclease):
指一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序
列，并在识别序列内或附近特异切割双链DNA 的核酸内切酶。
限制酶天然存在于细菌体内，与相伴存在的 甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰系统 （Restriction-Modification System)。
1.2限制性核酸内切酶的命名
Escherichia
Coli
Ry13
EcoR I
属名 种名 株系 编号 若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一
和第三个字母。
1.3 限制性核酸内切酶的分类
1.3.1 Ⅰ 型限制性内切酶 1.3.2 Ⅱ 型限制性内切酶 1.3.3 Ⅲ 型限制性内切酶
1.3.1 Ⅰ型限制性内切酶
酶量不超过总体积的 1/10
3L 0.1- 1g 2u
3 L 30 L
思考题
用限制酶BglⅡ消化2ｕg λDNA ，该 DNA浓度为 125ｕg/mL，BglⅡ为 4 units/ｕL.并提供了限制酶BglⅡ的10倍的 缓冲盐体系。请设计一最佳方案来完成 该实验
限制性内切酶的选择
原则：选常见的、活性高的酶， 如果双酶切最好选有公用 Buffer的酶 推荐酶：Promega公司， Takara公司，Tyoyobo公司
分布：主要在微生物中。 作用特点：特异性，即识别特定核苷酸序列，切割特定切点。 结果：产生黏性未端（碱基互补配对）。 举例：大肠杆菌的一种限制酶EcoRI能识别GAATTC序列， 并在G和A之间切开
(1) 基本特性
识别长度为4-8个核苷酸的特异序列；最常见的 为6个碱基. 许多识别序列具回文结构，如Hind Ⅲ 的识别序 列： 5` AAGCTT 3` 3` TTCGAA 5 切割产生的末端有粘端 (cohesive/sticky end) 如BamH I (G↓GATCC) 和平端 (blunt end) 如 Sma I (CCC ↓GGG)
(a)分子间连接
(1) · · · · · G 5´ AATTC· G· · · · · · CTTAA 5´ (2) · · · · · G 5´AATTC· G· · · · · · CTTAA 5´
(1) (2) · · · · ·G AATTC· · · · · · G 5´AATTC· G· · · · · · CTTAA G· · · · · · CTTAA
第二章 分子克隆工具酶
分子克隆工具酶
基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些 酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对
基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之
为“工具酶”。
工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优
化、而产生的生物工程产品。
工具酶