2 分子克隆工具酶（4学时）概述限制性内切核酸酶甲基化酶（Methylase）DNA聚合酶（DNA polymerase Ⅰ）其他分子克隆工具酶工具酶的定义o在生物技术中常用的各种工具酶系指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转录等有关的各种酶系统称为工具酶。

o基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。

所以把这些酶称之为“工具酶”。

o工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。

o自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。

这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的DNA 进而降解非己DNA的防御工具。

o本章主要介绍用于基因工程的各种工具酶。

常用的工具酶2.1 限制性内切酶(restriction enzyme)o限制与修饰（Restriction and modification）o限制酶识别的序列o限制酶产生的末端o DNA末端长度对限制酶切割的影响o位点偏爱（Site preference）o酶切反应条件o星星活性（star activity）o单链DNA 的切割o酶切位点的引入o影响酶活性的因素o酶切位点在基因组中分布的不均一性E.coli k 感染频率下降许多E .coli B 【E .coli B 限制λ（k ）】1. 限制与修饰现象①50年代后Luria 和Human(1952), Bertani 和Weigle (1953) 发现细菌的“限制”现象：2.1.1 限制与修饰（Restriction and modification ）E.coli B 修饰λ(k)*λ(k)感染E.coli(B)细菌如何对λ噬菌体进行限制和修饰?E.coli B对这些λ(K)进行了修饰。

表2-1 λ噬菌体不同感染株对E.coli 不同菌株的感染率111E.coli C 10-4110-4E.coli B10-410-41E.coli KλC λB λK λ噬菌体感染率E.coli 菌株细菌的限制—修饰系统①1962年W.Arber(瑞士)发现，寄主对噬菌体的修饰是在λPhage的DNA上。

②1965年，Arber发现修饰与λ的降解有关，提出：细胞中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，即细胞中有限制—修饰系统(R-MRestriction-modification system)。

甲基化是常见的修饰作用，可使腺嘌呤A 成为N 6甲基-腺膘呤，胞嘧啶C 成为5‘甲基胞嘧啶。

R-M系统是细菌安内御外的积极措施。

2.限制性内切酶的发现•1968年，Meselson从E.coli K株中分离出了第一个限制酶Eco K，同年Linn和Aeber从E.coli B株中分离到限制酶Eco B。

•1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到一种限制性酶Hin dⅡ，这是第一个分离到的Ⅱ类限制性内切核酸酶。

•HindⅡ限制性内切酶位点和切割位点如下：5 '…GTPy↓PuAC…3 '3 '…CAPu↑PyTG…5 '由宿主控制的限制与修饰作用限制性内切酶的命名o限制性酶采用三字母的命名原则，即属名+ 种名+ 株名的1个首字母，再加上序号，将限制性内切核酸酶的命名要点列于表。

表限制性内切核酸酶的命名要点Escherichia Coli Ry13E c o RⅠ属名种类株系编号3.限制与修饰系统的种类o根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子，限制与修饰系统至少可分为四类。

o在已纯化分类的3000多种限制性内切酶中，已发现了超过250种的特异识别序列。

表2-2 各种限制与修饰系统的比较YesYes No 限制作用是否需用ATP 同时竞争互斥分开的反应限制反应与甲基化反应在识别位点下游24-26bp 无特异性，至少在识别位点外1000bp 在识别位点中或靠近识别位点切割位点5-7bp 非对称非对称4-6bp, 大多数为回文对称结构识别位点二亚基双功能酶三亚基双功能酶(R ，M ，S 亚基) 内切酶与甲基化酶分子不在一起酶分子ⅢⅠⅡⅡ型（typeⅡ）限制与修饰系统o限制酶：一般是同源二聚体（homodimer），由两个彼此按相反方向结合在一起的相同亚单位组成，每个亚单位作用在DNA 链的两个互补位点上。

o修饰酶：单体，修饰作用一般由两个甲基转移酶来完成，分别作用于其中一条链，但甲基化的碱基在两条链上是不同的。

o它们识别回文对称序列（palindrome sequence），在回文序列内部或附近切割DNA，产生带3'-羟基和5'-磷酸基团的DNA 产物，需Mg2+，相应的修饰酶只需SAM 。

识别序列主要为4-6bp ，或更长且呈二重对称的特殊序列，但有少数酶识别更长的序列或简并序列，切割位置因酶而异。

oⅡs 型（type Ⅱs）限制与修饰系统，占5% ，与Ⅱ型具有相似的辅因子要求，但识别位点是非对称，也是非间断的，长度为4-7bp ，切割位点可能在识别位点一侧的20bp 范围内。

Ⅰ型（typeⅠ）限制与修饰系统o其限制酶和甲基化酶（即R亚基和M亚基）各作为一个亚基存在于酶分子中，另外还有负责识别DNA序列的S亚基，分别由hsdR、hsdM和hsdS基因编码，属于同一操纵子（转录单位）。

如Eco K编码基因的结构为R2M2S,Eco B 编码基因的结构为R2M4S2 。

o Eco B 酶的识别位点如下，其中两条链中的A *为甲基化位点，N表示任意碱基。

TGA*（N）8TGCTo Eco K 酶的识别位点如下，其中两条链中的A°为可能的甲基化位点。

AA°C（N）6GTGCo但是Eco B 酶和Eco K 酶的切割位点在识别位点1000bp 以外，且无特异性。

hsd: host specificity for DNA restrictionI类酶的作用方式(引自Lewin,1997)o在一定序列上识别DNA分子, 并能同DNA分子作用, 因其识别DNA后, 要朝一个方向或两个方向移动一段距离(通常为1000个碱基左右)，并且要形成一个环才能切割DNA, 所以识别位点和切割位点不一致，产生的片段较大。

Ⅲ型（type Ⅲ）限制与修饰系统o种类更少，所占比例不到1% ，如Eco P1 和Eco P15 。

它们的识别位点分别是AGACC 和CAGCAG ，切割位点则在下游24-26bp 处。

o Eco P1是由两个亚基组成，一个亚基(M亚基)负责位点识别和修饰。

另一个亚基(R亚基)具有核酸酶的活性。

切割DNA时需要ATP,Mg2+,也能被SAM激活，但并非必需。

oⅢ类限制性内切核酸酶(引自Lewin,1997)2.1.2 限制酶识别的序列1．限制酶识别序列的长度o限制酶识别序列的长度一般为4-8个碱基，最常见的为6个碱基。

o当识别序列为4个和6个碱基时，它们可识别的序列在完全随机的情况下，平均每256个和4096个碱基中会出现一个识别位点（44=256，46=4096）。

o注意：识别位点存在的概率不同！2．限制酶识别序列的结构o限制酶识别的序列大多数为回文对称结构，切割位点在DNA两条链相对称的位置。

o特例：（见下页举例）识别序列不是对称的识别多种序列识别的序列呈间断对称，对称序列之间含有若干个任意碱基。

Eco RⅠG↓AATTC Hin dⅢA↓AGCTTCTTAA↑G TTCGA↑A识别序列不是对称的Acc BSⅠCCG↓CTC Bss SⅠC↓TCGTGGGC↑GAG GAGCA↑C识别多种序列AccⅠGT↓MKAC，M=A或C, K=G或T识别的序列呈间断对称Alw NⅠCAGNNNC↓TG DdeⅠC↓TNAG GT↑CNNNGAC GANT↑C3．限制酶切割的位置o限制酶对DNA的切割位置大多数在内部，但也有在外部的。

在外部的，又有两端、两侧和单侧之别。

2.1.3 限制酶产生的末端1．限制酶产生匹配粘端（matched end）o识别位点为回文对称结构的序列经限制酶切割后，产生的末端为匹配黏端，亦即黏性末端（cohesive end）。

o若在对称轴5′侧切割底物，DNA双链交错断开产生5′突出黏性末端；o若在3′侧切割，则产生3′突出黏性末端。

NNG↓AATTCNN NNCTTAA↑GNN Eco RⅠNNG＋NNCTTAAAATTCNNGNN5’----NCTGCA↓GN----3’PstI5’----NCTGCA 3’----NG↑ACGTCN----5’3’----NGGN----3’ACGTCN----5’2．限制酶产生平末端（Blunt end）o在回文对称轴上同时切割DNA的两条链，则产生平末端，如HaeⅢ（GG↓CC）和Eco R V（GAT↓ATC）。

5’----NCCC ↓GGGN----3’SmaI5’----NCCC 3’----NGGG ↑CCCN----5’3’----NGGG +CCCN----5’GGGN----3’平末端o产生平末端的DNA可任意连接，但连接效率较黏性末端低。

3．限制酶产生非对称突出末端o当识别序列为非对称序列时，切割的DNA产物的末端是不同的，如Bbv CⅠ，它的识别切割位点如下：CC↓TCAGCGGAGT↑CGo有些限制酶识别简并序列，其识别的序列中有几种是非对称的。

如AccⅠ，它的识别切割位点如下:GT↓AT/CGACCATA/GC↑TGo有些限制酶识别间隔序列，间隔区域的序列是任意的，如DraⅢ，识别切割位点是CAC↑NNN↓GTG。

4．同裂酶（isoschizomer）o识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。

①同序同切酶识别序列和切割位置都相同，如HpaⅡ与MapⅠ识别切割位点为C↓CGG。

②同序异切酶KpnⅠ和Acc65Ⅰ识别的序列是相同的，但切割位点不同，分别为GGTAC↓C和G↓GTACC。

③“同功多位”许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能。

如Eco RⅠ为G↓AATTC，ApoⅠ为R↓AATTY，后者可识别前者的序列。

④其他有些限制酶识别的序列有交叉，如在pUC系列质粒的多克隆位点（multiple cloning site, MCS）中有一个SalⅠ位点（G↓TCGAC），该位点也可被AccⅠ（GT↓MKAC）和HincⅡ（GTY↓RAC）切割。

R=A,G Y=C,T5．同尾酶o许多不同的限制酶切割DNA产生的末端是相同的，且是对称的，即它们可产生相同的黏性突出末端。

这些酶统称为同尾酶（isocaudarner）。