W=A or T S=C or G
6：EcoRI HindIII
G AATTC A AGCTT
>6 Not I
GC GGCCGC 8
BbvCI CC TCAGC
7
PpuMI RG GWCCY 7
2.结构 ① 回文对称（旋转镜像对称） DNA两条链的对称位置。
切割位点在
EcoRI
GAATTC CTTAAG
化酶
酶
分子不在一起
4-6bp, 大多数 5-7bp 非对称 为回文对称结 构
在识别位点中 在识别位点下 或靠近识别位 游 24-26bp 点
分开的反应 同时竞争
限制作用是否 Yes
No
Yes
需用 ATP
类型II(type II)占93%
识别回文序列(palindromic sequence),
在回文序列内部或附近切割,产生带3’-OH和
•全部辅音按字母读,如pstⅠ
限制性酶和修饰酶的数量
早前上是限制性酶加R，是修饰酶加M,且菌株 号和序号小写 1968年 下半年 615R 98M 1998年 10000细菌 古细菌
3000种酶 200多特异性 到2006年2月为止,共发现3773种限制酶,810种 甲基化酶
到2011年？（查）
三、限制性核酸内切酶的类型
5’-P基团的DNA产物 需Mg2+,相应的修饰酶只
需SAM。
• EcoRI
GAATTC CTTAAG
识别序列(recongnition sequence)主 要为4-6bp,或更长且呈二重对称的特殊序 列。
但有少数酶识别更长的序列或简并序 列(degenerate sequence),切割位置因酶 而异,有些是隔开的。
裂口(gap)
缺口(nick) 切口= 断口(cut)
图1 ds-DNA结构: 裂口, 缺口, 断口
连接酶只能封闭缺口(nick),不能连接裂口(gap)。
• 切割位点可为获得DNA物理图(Physical map)的特殊标记
• 利 用 限 制 性 内 切 酶 （ Restriction endonuclease ） 切 割 产 生 特 殊 DNA 片 段 的能力使得纯化那些DNA片段成为可能。
3.核酸修饰酶类 ① 甲基化酶 ② 激酶 ③ 基因转移酶 ④ 磷酸酶
第一节 限制性内切酶
任何物种都有排除异物,保护自身的防御机制 • 人的免疫系统（immunity system） • 细 菌 的 限 制 与 修 饰 系 统 （ restriction and
modification system) 限制性内切酶（restriction endonuclease) 修饰酶 (modification enzyme）
3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-G-T-C…5’
5’…G-C-T-C-A-G-OH IIIIII
3’…C-G-A-G-T-C-P
Pvull 37ºC
P-C-T-G-C-A-G…3’ IIIIII
OH-G-A-C-G-T-C…5’
3.非对称突出端
① 来自非对称识别序列（非旋转对称） 当识别序列为非对称序列时,切割
一、限制与修饰 Restriction and modification
• 限制：细菌为防御外来DNA入侵而将其降解 的现象。（一般由限制酶来降解外源DNA)
• 修饰：细菌为防止自身DNA被降解而修饰自 身DNA。 (一般由甲基化酶进行修饰）
• 限制与修饰往往成对存在， • 它们的识别序列往往相同。
依据酶的亚单位组成 识别序列的种类 是否需要辅助因子分类 可分三类(I, II III) 也有分四类,IIs类,即II亚类
各种限制与修饰系统的比较
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
酶分子
识别位点
切割位点
限制反应与甲 基化反应
三亚基多功能 酶
二分非对称
无特异性，至 少在识别位点 外 1000bp 互斥
内切酶与甲基 二亚基双功能
限制酶识别序列的长度一般为 4-8 个碱基， 最常见的为 6 个碱基。当识别序列为 4 个和 6 个碱基时，它们可识别的序列在完全随机的 情况下，平均每 256 个和 4096 个碱基中会出 现一个识别位点（44 =256，46=4096）（原因：数 学排列组合）。
以下是几个有代表性的种类，箭头指切割位 置。
• 这种限制系统(restriction system) • 可排除外来的DNA
而自身的DNA由于甲基化，不能被限制 酶切割。
甲基化是常见的修饰作用: 可使腺嘌呤A 成为甲基-腺嘌呤, 胞嘧啶C成为甲基-胞嘧啶。
5’
GAATTC
3’
3’
CTTAAG
5’
EcoRⅠ
限制作用
M.EcoRⅠ
修饰作用
5’ 3’
列之间含若干个任意碱基。
AlwNI CAGNNNCTG
DdeI
CTNAG
3．切割位置
① 内部 大多数
AccBSI CCGCTC GGCGAG
(-3/-3)
Sau3AI GATC NlaIII CATG
③ 两侧 BcgI (10/12)CGA(N)6TGC(12/10)
DNA产物的末端是不同的
CCTCAGC BbvCI GGAGTCG
② 简并序列
AccI
GT/MKAC
GTATAC GTAGAC GTCTAC GTCGAC
③ 间隔序列 DraIII CACNNNGTG
EarI CTC T TC (1/4) GAG AAG
4.同裂酶(isoschizomer)
识别相同序列的限制酶称同裂酶。 但它们的切割位点可能不同。
HindIII
AAGCTT TTCGAA
② 非对称
AccBSI CCGCTC (-3/-3) GGCGAG
BssSI0
CTCGTG GAGCAC
③ 多识别序列 (简并序列) AccI GTMKAC ( M=A 或 C) HindII GTYRAC (Y=C 或 T )
④ 间断对称 一些限制酶识别的序列呈间断对称,对称序
3’…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’
2.平端 Blunt end
在对称轴上同时切割DNA的两条链
HaeIII
GG↓CC
EcoRV GAT↓ATC
XmnI GAANN↓NNTTC 产生平末端的 DNA 可任意连接，但连接
效率较粘性末端低。
5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-C-A-G…3’ IIIIII IIIIII
II亚类( type IIs)占5% • 识别位点非对称,非间断 4-7bp • 切割位点可能在识别位点一侧20bp范围内
某酶 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTNAG
R:与typeII具有相同的辅助因子要求 M:通常由两个M来完成,各作用一条链
限制酶识别的序列 1．限制酶识别序列的长度
具体可分为以下几种情况：
① 同序同切
这些酶识别序列和切割位置都相同。
HindII HincII GTY/RAC
HpaII HapII
C/CGG
MobI Sau3AI /GATC
② 同序异切
识别的序列是相同的，但它们的切割
位点不同。
KpnI Acc65I
Asp718I
GGTAC/C G/GTACC G/GTACC
属名
种名
•H：①宿主 属名第一字母（从分离的菌株属名取
第一个字母,大写）
•in：②种名前两个字母（从分离的菌株种名取前
两个字母,小写）
d: ③菌株代号或生物型号 Ⅲ: ④不同限制酶：如第三个限制酶（序号 罗马字）
Ｍ: ⑤修饰酶：甲基化 Ｍ．HindⅢ
读音： •有辅音和元音的拼起来读，
•如HindⅢ, EcoRⅠ
• 获得的限制性DNA片段可作为DNA操作中 的基本元件。
常用的工具酶
•1．使核酸降解的核酸酶类 (1) 核酸酶（作用对象不同） ① 核糖核酸酶 ② 脱氧核糖核酸酶
2)核酸酶（水解方式不同) ① 限制性核酸外切酶 ② 限制性核酸内切酶 限制性酶：具有特异性切割 非限制性酶：随机切割（无用）
２.催化核酸合成的酶类 ① DNA聚合酶 ② RNA聚合酶 ③ 连接酶
G/TCGAC GT/MKAC GTY/RAC
EagI EagI SalI SalI SphI SphI
5.同尾酶 许多不同的限制酶切割 DNA 产生的末端是
相同的，且是对称的，即它们可产生相同的粘 性突出末端。
这些酶切割 DNA 得到的产物可进行粘端连 接。以下几种酶产生的末端是相同的。由一对 同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位 点，特称之为“杂种位点”（hybrid site）。
10(N)CGA(N)6TGC(N)12 12(N)GCT(N)6 ACG(N)10
④ 单侧 BbvI GCAGC (8/12)
BspMI ACCTGC (N4) TGGACG(N8)
四、限制性内切酶产生的末端
1.粘性末端 （匹配粘端）
粘性末端是指DNA分子在限制酶的作用之下形成 的具有互补碱基的单链延伸末端结构。它们能够 通过互补碱基间的配对而连接起来。具平末端的 DNA片段则不易于连接。限制酶都可以产生两种粘 性末端，一种是形成具有3′-OH单链延伸的粘性 末端，另一种则是形成具有5′-P单链延伸的粘性 末端。
第二章
分子克隆工具酶
任课教师： 生命科学技术学院 生物工程系 王 莹 教授、博士
• 从基因工程技术过程来看，除了DNA和RNA 的提取、凝胶电泳、分子杂交和转化等一 系列外，极为重要的技术就是一系列酶催 反应。
• 基因工程是建立在酶催反应的基础上的， 其重要性不言而喻。