放免
试剂盒 特殊防护
仪器 治理污染
酶标
发光
三种免三种疫免测疫测定定技技术术的的成本成及本费用及费用
免疫分析技术基本原理
利用抗原、抗体之间的特异性结合来测定、分析特定物质的方法
抗原：可诱导动物免疫系统产生免疫应答的物质。 抗体：由动物免疫系统产生，可特异性结合某种物
质的球蛋白。
均相法（Homogeneous）
Hook(前滞)效应
线性范围
待测物浓度（X）
竞争法的剂量--反应关系曲线
信号强度（ Y ）
分析灵敏度（最低检测限）（95%可信度）： S0-2SD在该曲线上所对应的浓度值
功能灵敏度： 测定误差（变异）≤20%的最低可检测浓度
线性范围： （分析）功能灵敏度---变异≤20%的最高检测浓度
相关系数≥0.99的曲线范围
电压或电流信号
放大
主要特点
结构简单、性能稳定 但灵敏度低、线性范围较窄。
单光子计数式发光检测仪
单光子计数器
样品运动/定位装置 原位注射泵
计数/贮存器 打 印 机
程控高压
计
算
控制器
机
程控自动门锁及检测装置 发光仪执行模块
发光仪控制模块
光生物学技术的应用范围
军事侦测 公安稽查 卫生检疫 药物筛查 医学诊断 环境检测 航天遥感 生命科学
灵敏度(mol/L)
10-18 10-15 10-12 10-9
酶标
荧光
放免
发光
几种标记/检测技术线性范围的比较
线性范围
105 104 103 102
酶标
荧光
放免
发光
几种标记/检测试剂的有效期比较
有效期（月）
18 15 12 9 6 3 0
酶标
荧光
放免
发光
人人民民币币
100,000 80,000 60,000 40,000 20,000 0
商业化产品中常见的化学发光系统
鲁米诺及其衍生物的增敏化学发光系统
O
H2O2+
NH HRP NHOH- N2
NH2 O
CO2+Photon (425nm)
CO2NH2
增强剂（Enhancer）
OH
N
R
BR
OH
OH
OH
R
S
发光信号检测
光敏二极管、光敏电池、光电偶合器（CCD） 原理
光信号
光电转换器件
……
已成为现代生物技术最活跃的领 域之一
光生物学检测技术的优越性
彻底消除了放射性危害
无半衰期限制，试剂稳定 性和有效期大大延长
容易实现连续、动态、重 复测定
适合于复合标记系统进行多指 标并行测定
操作简单，反应速度快，容易 实现自动化
灵敏度和线性范围超过以往技 术
几种标记/检测技术灵敏度的比较
洗涤去除未结合的反应物
仪器检测
反应0-5分钟
发光免疫分析技术 的现状及应注意的问题
目前已商品化的光生物学标 记检测技术整体性能比较
技术类型 标记、反应体系
主要优点
主要不足
酶 促 化 学 发 光 非 酶 促米 诺、氧化剂、增强 剂等
螺旋金刚烷环氧化 物、碱性磷酸酶
吖啶酯、过氧化氢
测量方式简单（速率 法）成本较低、灵敏 度较高
测量方式简单（速率 法）灵敏度较高
灵敏度较高
铕（Eu）、镝(Dy)、 灵敏度较高、试剂较
钐（Sm）、铽
稳定
（Tb）、等络合物
脉冲光源激发
钌(Ru)的络合物脉 冲电场激发
工作曲线随时间漂移低端斜率呈非线性下移
试剂成本高、发光时间短测量方式复杂（积 分法）需原位进样(In Situ Injector)仪器成 本及维护费用较高试剂成本较高 测量方式复杂（脉冲激发、间歇式测量、流 动池）仪器成本及维护费用高环境及样品中 同类元素可导致本底干扰
免疫凝集法： 自然凝集：血型测定 肥达氏反应； 敏化凝集：血球凝集法 凝胶（微粒）比浊法
免疫扩散法；免疫电泳法近场液闪法， 酶--辅酶（亚基）配位法 荧光偏振法，荧光共振法 吖啶酯水解法，生物传感器
非均相法（Heterogeneous）
免疫印迹（Western-blot）：基因表达分析、HIV感染确认实验 免疫组织化学技术：原位基因表达分析、临床病理学分析 纸片法：早孕快速检测、吸毒检测快速、献血快速检测 放射免疫法（RIA）：沉降法（放免）、固相法（免放，IRMA） 荧光免疫法（FIA）；酶联免疫法（EIA，ELISA） 酶联荧光法（FEIA）、化学发光法（LIA） 酶联化学发光法（ELIA）、时间分辨荧光法（DELFIA）、电化
线性范围
待测物浓度（ X ）
发光免疫分析基本操作步骤（一步法）
待测样品
标记抗体或抗原
包被抗体或抗原的反应管 反应30-60分钟
洗涤去除未结合的反应物
发光底物
仪器检测
反应0-5分钟
发光免疫分析基本操作步骤（二步法）
待测样品 标记抗体或抗原
发光底物
包被抗体或抗原的反应管 反应30-60分钟
洗涤去除未结合的反应物 反应30-60分钟
学发光法（ECLIA）；……
夹心法的剂量--反应关系曲线
信号强度（Y）
分析灵敏度（最低检测限）（95%可信度）：
S0+2SD在该曲线上所对应的浓度值。
功能灵敏度： 测定误差（变异）≤20%的最低可检测浓度。
线性范围： （分析）功能灵敏度---变异≤20%的最高检测浓度
相关系数≥0.99的曲线范围
这些发光检测技术的灵敏度及线性范 围都已经接近了免疫反应的极限。
片面宣扬检测技术灵敏度和线性范围的强 弱，不仅毫无意义，而且也是荒谬的。
灵敏度的瓶颈在于抗体亲合力和干扰 免疫反应的因素，而不是检测技术。
筛选抗体、屏蔽干扰，生产工艺、管理 水平和技术服务是试剂生产的关键
例如：电化学发光TSH检测试剂的分析灵敏度为0.005mIU/L 第四代化学发光TSH检测试剂的分析灵敏度为0.001mIU/L 原因在于抗体的亲合力，而不是检测技术。
发光技术—— 临床免疫分析划时代的进步
普通放免 功能灵敏度1-2mIU/L
基本无法测到 正常值下限以下 的血清TSH浓度 对甲亢的诊断意义不大
固相放免 功能灵敏度 0.1-0.2mIU/L 在甲亢的诊断中 开始发挥作用
时间分辨荧光（也称时间延迟光致发光）：Time Resolved Fluorescence （Time Delayed Photoluminescence）解离增强荧光免疫分析（DEFIA）
电化学发光（也称场致发光）：Electrochemiluminescence（Electroluminescence） 化学发光：Chemiluminescence