（二）基因表达载体的构建
质粒
重组DNA 限制酶
目的基因
DNA连接酶
（二）基因表达载体的构建
1.构建目的 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可遗传给下
一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。 2.构建零件及其作用
（1）目的基因 （2）启动子 RNA聚合酶识别 和结合的一段特殊结构的DNA 片段，位于基因的首端，RNA 聚合酶与之结合才能驱动基因 转录出mRNA，进而获得需要的 蛋白质。
逆转录酶 核酸酶H DNA聚合酶
与载体连接 该生物 导入受体菌群 cDNAmRNA 杂交双链 单链DNA
双链DNA
2.利用PCR技术扩增目的基因 (1) 原理 PCR是聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）,它是利用DNA 双链复制的原理，将基 因的核苷酸序列不断的加以复制，使其数量呈指 数方式增加。因为整个过程是在体外进行，所以 又叫做体外DNA扩增技术。
3.种类： 质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒
质粒
• 细菌拟核DNA之外能自主 复制的小型双链环状DNA 分子；
• DNA分子上具有多个限制 酶切割位点；
• 能在宿主细胞中进行自我 复制；
• DNA分子上具有特殊的标 记基因；
• 对宿主细胞无影响。
二、基因工程的基本操作程序
第一步 第二步 第三步 第四步
（二）DNA连接酶——“分子缝合针”
1.连接酶的作用：将互补配对的两个黏性末端连接起来， 使之成为一个完整的DNA分子
磷酸二酯键
GA A T T C C T T A AG
磷酸二酯键
2.连接酶的部位： 磷酸二酯键，不是氢键
3.连接酶的类型（按来源分类）
(1)E.coli DNA连接酶： 只能连接双链DNA片段互补
2. 过程
高温变性(DNA解旋) （90~95℃）
低温退火(引物结合) （55~60℃）
多次 重复
中温延伸(互补链合成) （70~75℃）
3.特点：指数形式扩增
双链DNA是在高温条件下解链为单链DNA的，因此整个 过程不需要解旋酶。
3.通过DNA合成仪直接合成目的基因 当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以
测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。
蛋白质的氨 推
mRAN
推 基因DNA的 合
基酸顺序 测 核苷酸序列 测 核苷酸序列 成
目的 基因
DNA合成仪
（二）基因表达载体的构建
用限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目 的基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切 口上的黏性末端互补配对后，在连接酶的作用下 连接形成重组DNA分子，即基因表达载体。
获取目的基因 构建表达载体 导入受体细胞 目的基因检测与鉴定
（一）目的基因的获取1.从基因中获取目的基因将含有某种生物不同基因的许多片段，导入受体菌的 群体中储存，各个受体菌包含了某种生物所有的动物
发 雌性动物输卵 育 管或子宫
含目的基因 的受精卵
分分 化裂
移 早期 植 胚胎
3.导入微生物细胞 (Ca2+ 处理法) (1)过程
•菌制易备于感接受受态外细源胞D：NA用分C子a2。+（CaCl2）处理细菌，使细 • 重组DNA分子与感受态细胞混合孵育，完成转化。
(2)优点
繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少、操 作简单、价格低廉。
(3)常用受体细胞
大肠杆菌（E.coli）
（四）目的基因的检测与鉴定
目的基因是否真正插入受体细胞的DNA中，是否能 够在受体细胞中稳定遗传和正确表达，只有通过检测、 鉴定才能得知。
常用的检测手段主要从分子水平和个体水平进行。
1.分子水平（分子杂交技术）
显出 杂交带
（表明目的基因已转录出了mRNA）
检测DNA利用的是DNA与DNA杂交，检测 mRNA利用的是DNA与mRNA杂交。
1.分子水平（分子杂交技术）
（3）检测目的基因是否翻译出蛋白质 （抗原—抗体杂交技术）
提取受体生 与相应抗体杂交 显 出
物的蛋白质
杂交带
（表明目的基因已形成蛋白质产品）
2.个体水平
（1）检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因
提取受体生 适当限制 物全部DNA 酶切割
许多 DNA片段
用同位素标记的 显 出 目的基因片段杂交 杂交带
（表明目的基因已插入）
1.分子水平（分子杂交技术） (2) 检测目的基因是否转录出了mRNA
提取受体生 物的mRNA
用同位素标记的 目的基因片段杂交
（二）基因表达载体的构建
2.构建零件及其作用
（3）终止子 一段特殊结构 的DNA片段，位于基因的尾端， 作用是使转录在所需要的地 方停止。
（4）标记基因 鉴别受体细胞 中是否含有目的基因，从而将含 有目的基因的细胞筛选出来。
(5) 复制原点
（三）将目的基因导入受体细胞
将目的基因导入受体细胞并且在受体细胞内维持稳 定和表因的构建 基因组的构建提取某生物用适当
许多
全部DNA 限制酶切割 DNA片段
与载体源于大肠杆菌) 的粘性末端
(2) T4 DNA连接酶： 既可以连接双链DNA片段 互补的 （来源于T4噬菌体） 粘性末端，又可以“缝合”双链
DNA片段的平末端
（三）基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
1.作用： 将外源基因送入受体细胞
2.条件： • 能在宿主细胞内复制并稳定地保存； • 具有多个限制酶切位点,便于目的基因插入； • 具有标记基因，便于筛选； • 必需是安全的，对宿主细胞无害。
基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、 土壤农杆菌和动植物细胞等。
导入受体细胞的方法主要是借鉴细菌或病毒侵染细 胞的途径，且因受体细胞的不同而不同。
1.导入植物细胞 （1）农杆菌转化法
（2）其他方法 • 基因枪法 • 花粉管通道法
2.导入动物细胞 (显微注射技术)
含目的基因 显微 的表达载体 注射