3. 氨解脱保护 合成完毕后取出载体进行切割并且脱保护。
一般40bp以内至少需要2小时，链越长需要 时间越长。
4. 纯化: 目前惯用的纯化方式主要有4种： OPC纯
化、 PAGE 纯化、脱盐纯化、 HPLC纯化
4.1 OPC纯化
利用OPC柱芯对DMT寡核苷酸特殊的亲和 力，将不带DMT的短片段用低浓度的有机溶剂洗 脱，吸附在柱芯里的DNA用酸除去DMT后用1ml 的20%乙腈洗脱。
缺点：不能批次生产，比较费时，有时样品接 收不好也不能有效分离。
5. 样品定量分装 样品纯化后洗脱在1ml的20%乙腈溶液
里，260紫外波长下测值，根据客户要求分 装，一般所有合成公司基本都会按1.2-1.5 倍放大给量。分装的样品干燥，经PAGE抽 样检测合格后交给市场。
合成时效：批次引物（按24条计算）在24小时之内可 以出货
DNA合成作业流程
1. 接收订单安排合成
合成部根据合成实际情况合理安排订单， 依次安排加急-测序-内部-外部，同一客户尽 量同批次安排合成，部分长链、G含量高、 合成量大的引物比较难合成，时间上可能会 有所延缓
2. 上机合成
不同型号的合成仪合成通量和合成时间均 不同，公司预定的仪器批次合成96条引物， 20bp长度合成需要2-3小时。
④氧自由基伤害 细胞代谢副产物O2-、H2O2等会造成碱基损伤，产生胸腺嘧啶乙二醇、羟甲基尿 嘧啶等碱基修饰物，引起碱基配对错误。
三、 碱基插入或缺失 吖啶类分子带正电呈扁平状，易于嵌入DNA碱 基平面间，导致在复制或重组过程中缺失或插 入一个碱基。 DNA聚合酶在复个碱基的缺 失或插入。聚合酶在模板链上滑动易于造成缺 失，在生长链上滑动易于造成插入。 插入或缺失会导致读码框改变。
DNA合成原理 及操作规范
合成原理
DNA通过固相亚磷酰胺三酯法合成：溶 液中的亚磷酰胺单体通过缩合反应形成 3′--5′磷酸二酯键，连接到固相载体 （CPG或树脂）上。并依次延伸，直到 序列的最后一个5′碱基连接上后合成结 束。整个合成过程仪器自动完成，每个 循环分为脱保护、活化、偶合、盖帽 （封闭）、氧化五个步骤。
通常合成一批20bp左右的引物：
OPC纯化：12小时之内
合成2-3小时→ 氨解2小时→ OPC纯化（一批24条） 1小时→定量分装1小时→ 抽干1-2小时→ 抽检2小时
PAGE纯化：16-19小时
合成2-3小时→ 氨解2小时→ 抽干2-3小时→ 电泳切 胶2-3小时→ 泡胶2小时→ 脱盐0.5小时→ 定量分装1 小时→ 抽干2-3小时→ 抽检2小时
1、Taq酶的原因。因为在PCR扩增时引物也被扩增,就可能出现错误 ， 2、化学原因 。在合成过程中，如果本公司提供的DNA合成报告单是正确
的，表示合成是成功的 。化学合成的DNA片段要比天然的DNA片段有 更多的碱基突变概率。但其真正的化学机理还不太清楚，但可以肯定的 是要保证100％不发生错误是不可能的。 解决的办法： 1、采用高保真的 Taq酶 2、重新挑克隆 3、重合引物
脱盐纯化：12-15小时
合成2-3小时→ 氨解2小时→ 抽干2-3小时→ 脱盐0.5 小时→ 定量分装1小时→ 抽干2-3小时→ 抽检2小时
DNA合成中碱基缺失或错误原因分析
一般客户提出异议时，我们首先给客户重新合成，然后再分析原因。 从合成机理上分析就可以很清楚的表明：人为的因素不可能造成碱基缺 失或个别的碱基错误。如果说某一个碱基由于种种原因(如瓶中溶液没有 了，或管道堵塞)，未加入到正在延伸的Oligo上，那么下一个反应 Capping将会把Oligo封死，使整个oligo合成立即中止 。造成的原因可能 是：
优点：方便，快捷，纯化后纯度可达90%， 能满足普通PCR反应。
缺点：纯化成功与否取决于粗品DNA的纯度， 合成不好的样品可能OPC纯化后也不纯，并且随 着碱基数增多，纯化效果降低；由于在纯化过程 中接触到酸，引物容易降解。
4.2 PAGE 纯化
利用DNA不同片段在胶中迁移率不同而 分离，大片段电荷多，分子大，迁移的速度 慢。等目的片段与N-片段分开后切下目的片 段，80℃孵育2小时后脱盐。
c. 黄曲霉素 黄曲霉素B、1,2-乙酰-氨基芴、苯并芘、吖啶等可插入碱基序列，引起移码。 d. 硝酸盐 亚硝酸盐能使C脱氨变成U，经过复制就可使DNA上的G-C变成A-T对。
③碱基的自发改变和损伤 a. 碱基的异构互变 4种碱基各自的异构体间都可自发地互变（烯醇式与酮式间的互变），这会使碱基 间发生错配，使A-C、T-G等。 b. 碱基的脱氨基作用 碱基的环外NH2有时会自发脱落，使C→U、A→次黄嘌呤（I）、G→黄嘌呤（X） 等，DNA复制时，U-A、I-X、I-C配对，导致子代DNA序列错误。 5-甲基胞嘧啶脱氨基产生T（引起C-G→T-A的变化），而C脱氨基产生U（它通常 被移出或被C代替）。
DNA损伤
一、碱基脱落形成AP位点 热和酸等都可使嘌呤和嘧啶从DNA链的核糖磷酸骨架上脱落，形成AP位点 （Apurinic orApyrimidinic site ）。 烷化鸟嘌呤的糖苷键不稳定，容易脱落形成DNA上无碱基的位点。
二、碱基的改变
①物理因素：电离辐射可引起其它物质产生自由基，从而引起碱基氧化修饰、过氧 化物的形成、碱基环的破坏和脱落等。一般嘧啶比嘌呤更敏感。 ②化学因素 a. 烷化剂 硫酸二甲酯、甲烷磺酸甲酯（MMS）等烷化剂可将烷基加到嘌呤或嘧啶的N或O上 使碱基烷基化。鸟嘌呤的N7和腺嘌呤的N3最容易受攻击，形成m7G和m3A烷基化 的嘌呤碱基，导致复制时碱基错配。例如鸟嘌呤N7被烷化后会与T配对，结果会使 G-C转变成A-T。 b. 碱基类似物 5-溴尿嘧啶（5-BU）、5-氟尿嘧啶（5-FU）、2-氨基腺嘌呤（2-AP）等。它们的结 构与碱基相似，进入细胞能替代正常的碱基参入到DNA链中而干扰DNA复制合成。 如5-BU与T结构相似，在酮式结构时与A配对；它更易成为烯醇式结构与G配对，在 DNA复制时导致A-T转换为G-C。
四、 嘧啶二聚体 DNA受到紫外线照射时，使DNA链上相邻的嘧啶以 共价键连成二聚体。 相邻2个T；或2个C；或C与T间都可形成环丁基二聚 体；相邻2个T间最易形成TT二聚体。
五、DNA链断裂 电离辐射可使DNA链断裂；射线的直接和间接作用 都可能使脱氧核糖破坏或磷酸二酯键断开而致DNA 链断裂。 烷化剂也可使DNA链断裂；DNA链的磷酸二酯键上 的氧易被烷化，结果形成不稳定的磷酸三酯键，在 糖与磷酸间发生水解，使DNA链断裂。
第三步：偶合（Coupling）:亚磷酰胺四唑中间体与CPG所连接的核苷酸的5′ 羟基发生缩合反应，缩合脱掉四唑，形 成延长一个碱基的核苷酸链。
第四步：盖帽（Capping）:少量未反应 （2%）的载体上的核苷酸链的5′羟基会 在后续的循环中参加反应，生成少一个 碱基的核苷酸链，因此需要在反应后进 行封闭。常用乙酰化反应与5′羟基缩合 成酯键，一般用混合乙酸酐和N-甲基咪 唑等做乙酰化试剂。
第五步：氧化（Oxidation）:偶合反应形 成的三价亚磷酸酯键很不稳定，因此要 用氧化剂——碘的四氢呋喃溶液将三价 磷氧化成稳定的五价磷。
依此步骤循环，最终得到一个全长 DNA片段粗品。 用新鲜的浓氨水把粗品 从载体上切割下来，采用适当的纯化方 式去除短片段和氨基脱保护及氰乙基脱 保护形成的盐离子。
第一步：脱保护（Deblocking）:用三氯乙酸 （TCA）去除CPG所链核苷上的DMT保护 基团，暴露5′羟基，供下一步缩合。
第二步：活化（Activation）：单体与催化 剂四唑混合进入合成柱，四唑转移一个质子 给3′亚磷酸上二异丙胺基的N原子，质子化 的氨是四唑亲核进攻的离去基团，二异丙酰 胺被四唑取代，形成亚磷酰胺-四唑活性中 间体。
4.4 HPLC纯化 HPLC吸附基质分反相柱和离子柱： RP(反相柱）是根据疏水性的差别来分离的：疏
水性更强的长片段比短片段在柱内保留的时间更长。
离子柱是根据不同长度的寡核苷酸带有不同的 净电荷，通过缓慢增加流动相的离子强度将n-片段 先洗脱。
优点：纯化效果好，纯度可达99%以上，特别 是对标记引物，特殊探针特别有用。
优点：分离效果好，纯度能达到98-99%， 可以满足测序、克隆等用。引物也很稳定。
缺点：比较费时费力，样品损失很大。
4.3 脱盐纯化 如果偶合效率高，合成效果好，粗品本
身没有什么短片段，可以直接脱盐。 优点：省去PAGE电泳的麻烦，样品回
收率高。 缺点：不能有效去短片段，前提一定要
合成效果很好才选用此方法。