• 稀释，ddH2O按报告单储存浓度（100μM）的10倍量稀释至使用浓度10μM • 保存，分装-20℃
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
Attention
• 离心时待离心机达到最高转速方可离开，防止不平衡造成损坏 • μM 是浓度单位，如100μM=100μmol/L • 引物稀释量向上取5倍整数，如383μl稀释至385μl
T4 DNA Ligase Total
用量 13-15μl
2-4μl 2μl 1μl 20μl
• 混匀，4℃过夜或常温条件下反应4h
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
Objective
• 将连接产物通过转化转入到感受态大肠杆菌中，从而使连接产物（重组质粒）在大肠 杆菌中大量复制
LB培养基配制
2μl
enzyme 1
2μl
enzyme 2 dd H2O
2μl 补至50μl
enzyme 2 dd H2O
2μl 补至50μl
*根据质粒浓度（如pcDNA3.1+3flag浓度为455ng/μl，4000bp，反应体积约为9μl）
• 混匀，37℃孵育4-6h（6h以上更佳）
引物设计
pCR
回收纯化
凝胶浓度 0.5% 0.7% 1.0% 1.2% 1.5% 2.0%
目的基因片段(bp) 1000-30000 800-12000 500-10000 400-7000 200-3000 50-2000
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
Attention
• 琼脂糖凝胶可根据情况分成数小块（一般是每8孔）， 或插入孔径不同的梳子
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
Primer Premier 5
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
引物处理 Procedure
• 标记，Sense → F，Antise → R ，如“NS3 Sense BamH1”，记为“NS3-F-BamH1”
• 离心，使粉末在底部集聚，12000g，10min（注意是g，不是rpm）
pLenti+3flag pLenti+3flag pLenti+3flag
pLenti+3flag pLenti+3flag pLenti+3flag
备注
有2个突变 有2个突变 有2个突变
没有突变 没有突变 没有突变
有2个突变 有3个突变 有2个突变
结果
成功 成功 成功
成功 成功 成功
失败 失败 失败
胰蛋白胨（Tryptone） 酵母提取物（Yeast extract）
备注 中间有3个位点突变 中间有3个位点突变 中间有3个位点突变
中间有2个位点突变
不配对 双峰 中间有1个位点突变
测序有问题，需要沟通 测序有问题，需要沟通 测序有问题，需要沟通
需要重新设计引物，直接pcr 需要重新设计引物，直接pcr 需要重新设计引物，直接pcr
需要重新设计引物，重新实验 需要重新设计引物，重新实验 需要重新设计引物，重新实验
pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
琼脂糖凝胶电泳
• 琼脂糖凝胶具有网络结构，本身不带电荷。具有分子筛效应(凝胶色谱)与电泳效应。
• 目的：分离不同大小的核酸，以达到纯化、鉴定的目的。 • 原理：DNA分子迁移率与其大小成反比，电泳时
根据分子大小不同形成不同的条带 • 根据目的基因片段大小，配制不同浓度的凝胶
成功
成功 成功 成功
成功 成功 成功
成功 成功 成功
目的基因 NS3-1 NS3-2 NS3-3
NS4A-1 NS4A-2 NS4A-3
NS4B-1 NS4B-2 NS4B-3
NS4A+2K-1 NS4A+2K-2 NS4A+2K-3
NS5-3
E
prM-1 prM-2 prM-3
M-1 M-2 M-3
*凝胶成像仪的紫外灯对DNA有突变作用，应尽可能减少紫外灯对凝胶的照射
• 按照E.Z.N.ATM Gel Extraction Kit(200)试剂盒说明书回收纯化DNA：
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
Objective
• 原理：限制性内切酶能特异地结合于一段特定的DNA序列的特异位点上,并切割双链 DNA
• EB具有强致癌性，应在污染区操作
• 为保持凝胶成像仪与点样顺序一致，点样时应从右往 左点（靠近自己一段开始）
• Marker是已知大小的正对照DNA，电泳能分离出不同 条带，相当于尺子上的刻度，可以用来测算未知DNA 样品的大小。
• 红色为正极，黑色为负极，DNA 样品由负极往正极泳 动（靠近加样孔的一端为负)。
390bp 390bp 390bp
1854bp 1854bp 1854bp
859bp 859bp 859bp
336bp 336bp 336bp
2700bp 2700bp 2700bp
1485bp
339bp 339bp 339bp
498bp 498bp 498bp
225bp 225bp 225bp
质粒载体 pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
，向上取整数（多预留延伸时间）
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
Attention
• 试剂如不完全融化，会造成浓度不均，酶需冰上放置 • PCR管根据目的基因名称、日期、编号做标记 • 模板(Template)可根据浓度确定加入体积，缓冲液(Buffer)必须在酶之前加入。 • 注意不同引物对应不同PCR管 • PCR 结果优化略，详见《pCR常见问题解决方法》
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
E E Cap Cap Cap Cap 2B 2B 2A 2A NS1 NS1
2000bp
1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp
Байду номын сангаас物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
Procedure
• 打开紫外灯，在操作台上根据荧光位置切胶，动作要快并尽可能切小块，切出的凝胶 转移至1.5ml Ep 管里，称量凝胶重量
长度 1854bp 1854bp 1854bp
381bp 381bp 381bp
744bp 744bp 744bp
450bp 450bp 450bp
2700bp
1485bp
498bp 498bp 498bp
225bp 225bp 225bp
质粒载体 pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
pcDNA3.1 +3flag
重组质粒 pcDNA3.1+3flag-NS3
引物设计
pCR
回收纯化
双酶切
连接
转化
挑菌
提质粒
测序
大肠杆菌(感受态)
酶切鉴定
载体 目的片段
实验流程
网上检索 引物设计
DNA制备
生物信息学 分析等
PCR扩增
扩增产物 纯化
与克隆载体 连接
感受态 E.coli制备
转录
翻译
DNA
RNA
逆转录
蛋白质
基因克隆
• 基因克隆（gene cloning）或分子克隆，又称为重组DNA技术，是应 用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重 新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量 的子代DNA分子的过程。
• 目的：大量扩增目的基因，为下一步基因的功能研究做准备。
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag
pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag pcDNA3.1+3flag