超声波破碎法
化学破碎法： 甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有机溶剂和Triton、
Tween等表面活性剂
酶促破碎法
自溶法 加酶处理
G+菌：溶菌酶 G-菌：溶菌酶、巯基乙醇等 酵母菌：β-葡聚糖酶和溶菌酶 霉菌：几丁质酶
四、抽提 指在一定的条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充
分溶解到溶剂中的过程，也称为酶的提取。
2、按膜孔径或截留物质的大小：
微滤 —— 超滤 —— 纳滤 、电渗析 、透析 —— 反渗透
膜
孔
径大
小
灰尘 细菌
膜
病毒 生物大分子 生物小分子 盐类 水
灰尘 细菌 病毒 生物大分子
生物小分子 盐类 水
微滤（MF）
（0.2-2um）
超滤（UF）
（10-200nm）
灰尘 细菌 病毒 生物大分子 生物小分子
选择性热变性法、选择性酸碱变性法、 选择性表面变性法
亲和层析、亲和电泳
ห้องสมุดไป่ตู้
第三节 酶的沉淀分离
盐析沉淀法√、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、复合沉淀法
一、盐析沉淀法 1、原理： 2、硫酸铵盐析的优点
优点：①在水中溶解度大，溶解的温度系数小； ②价廉，便宜； ③可保护酶。
缺点：溶解过程随浓度增加的体积变化是非线性的变化。
(25℃)
当溶液体积不大，要达到的盐浓度不高，可以加 入饱和硫酸铵溶液；当溶液体积较大，要达到的盐 浓度又较高，此时加入固体硫酸铵较好。
4、为了得到较好的盐析效果，应控制下列因素
（1）不同酶，盐析时所需的盐浓度各不相同。实际料液中目 标酶的盐析沉淀操作前，所需的硫酸铵浓度或饱和度可通过实 验确定。
（2）加盐操作时，防止局部盐浓度过高，防止产生泡沫。
（3）pH值和温度：等电点附近，室温或低温操作。
（4）蛋白质浓度：样品液的蛋白质浓度一般控制在2.5~3.0% 为宜，太浓时应适当稀释，以减少杂蛋白共沉淀。 （5）脱盐：超滤、透析或层析。
（二）等电点沉淀
1、原理 2、实际操作
与其他方法一起使用（盐析、有机溶剂沉淀、复合沉淀）。 单独使用时，主要是用于从粗酶中除去某些等电点相距较 大的杂蛋白 。
中空纤维超滤膜组件
渗出液
清洗液出口 （c）
渗出液
清洗液
五、膜及膜的使用性能
（一）、膜的结构和制膜材料 表层：孔径各异，厚度为0.1~5um
膜 基层：起支持作用，厚度为50~250um
制膜材料：醋酸纤维素、硝酸纤维素、聚砜、聚酰胺等
（二）、膜的使用性能 （1）透水率（透水通量、流率）； （2）截留率； （3）截留物相对分子质量
实验室和生产中通常利用微滤技术除去或收集酶发酵 液中的细胞。
无菌水、矿泉水、纯生啤酒的生产。热敏性药 物和营养物质的过滤除菌等
（二） 超 滤(UF)
可截留溶液中溶解的大分子物质，而透过小分子物质。
（1）截留颗粒直径：10~200 nm。 （2）操作压力：0.1~0.7MPa。
（3）应用：一是分离纯化，从高分子物质与低分子物质的溶 液中，使低分子物质透过膜；二是溶液的浓缩。
第四章 酶的分离纯化及产品成型
4
本章知识点：
（
的）
（1）酶的抽提
纯酶
（2）酶的分离纯化：沉淀分离、离心分离、
度 监
纯 化
膜过滤、层析分离、电泳分离 测 过
（3）酶液的浓缩、结晶、干燥、成型
程
一、生物下游加工技术
下游加工过程包括目标产物的提取、浓缩、纯化及成品化 等过程。 生物产物从原料（培养液或细胞）生产到产品的后处理技 术（分离纯化技术）的发展，使低成本、高收率地纯化目标 产物成为现实。
盐类 水
灰尘 细菌 病毒 生物大分子 生物小分子 盐类
水
纳滤（MF） 反渗透滤（RO）
（2-10nm）
（＜2nm）
各种膜分离法的原理和应用范围
膜分离法 截留的颗粒大小 截留的主要物质 过滤介质 应用举例
微 滤（MF） 0.2~2um
超 滤 （UF） 10nm~200nm 纳滤
（NF） 2nm~10nm 反渗透 （RO） <2nm
3、盐析操作 （1）硫酸铵的饱和度
实际浓度 （NH4）2SO4 的饱和度（%）= 饱和浓度 ×100%
0.4S = 40%（饱和度）
（2）调整盐浓度的方法
例：将2升0.2S的硫酸 铵溶液提升至0.5S，需加饱
和硫酸铵多少升？溶液体积
加饱和（NH4）2SO4 溶液： 增加多少倍？
V=
V0（S2 - S1） 1 - S2
PAA + 酶 + Ca 2+
PAA- Ca 2+ + 酶
PAA- Ca 2+ + SO4 2-
CaSO4 + PAA
（五）选择性变性沉淀法
选择一定的条件使酶液中存在的某些蛋白质等杂质变性 沉淀，而不影响所需的酶。
1、热变性法：根据目的酶与杂蛋白热稳定性差异，可以在 较高温度下，使杂蛋白变性沉淀，而酶则保持可溶状态。
在电场作用下，带电离子透过膜向两极移动，而达到分离 的目的。
+
膜
-
膜
酶液
-
+
应用：电渗析主要用于酶液或其他溶液的脱盐、海水淡化、 纯水制备等
（五） 透析
应用：在生物分离方面，主 要用于生物大分子溶液的脱盐。 由于透析过程以浓差为传质推 动力，膜的透过通量很小，不 适于大规模生物分离过程，而 在实验室中应用较多。
灰尘、细菌
微孔滤膜
除菌，回收 菌
生物大分子及以上 超滤膜
蛋白质、多 肽和多糖的 回收和浓缩
生物小分子及以上 纳滤膜 脱盐、浓缩
盐类及以上
盐、氨基酸、 反渗透膜 糖的浓缩、
淡水制造
二、酶分离纯化中几种常见的膜分离技术
（一） 微 滤(MF)
又称微孔过滤，是以微滤膜作为过滤介质的膜分离技术。
（1）截留颗粒直径：0.2~2 um。 （2）操作压力：低于0.1 MPa。 （3）应用：
3680Kg
经验常数W — 将01℃L饱和度10为℃S1的溶20液℃提高2到5℃S2所 30℃
要添加的固体硫酸铵克数；
A
0.271 0.281 0.290 0.294 0.298
A、B — 与温度有关的经验常数
B（g/L） 514.72 525.05 536.34 541.24 545.88
（mol/L） 3.09 3.97 4.06 4.10 4.13
三、酶分离纯化的基本原则
（一）酶分离纯化包括三个基本环节
抽提
纯化
精制
（二）酶分离纯化应注意以下问题
1、防止酶变性失活：温度、pH、泡沫、重金属等。 2、选择有效的纯化方法。 3、酶活性测定与总蛋白质含量测定应贯穿纯化过程的 始终。
第一节 从发酵液制取酶提取液（酶溶液的制备）
一、发酵液的预处理 目的：降低粘度，便于固液分离 方法：（1）加热：
至会导致一次工业革命的重大生产技
渗出液
术，所以可以称为前沿技术，是世界
各国研究的热点。
广泛应用于生物工程、化学、制药、 饮料、电力、冶金、海水淡化、资源 再生等领域。
一、膜分离的类型
1、按推动力不同可分为： （1）扩散膜分离：渗透、透析 （2）压力差膜分离：微滤、超滤、纳滤、反渗透 （3）电位差膜分离：电渗析
硫酸铵盐析
免疫亲和层析
阳离子交换层析 仅三步，总收率达81.0%
在实践工作中选择方法时:
首先，应对被纯化的酶的理化性质有—个比较全面的了 解;
其次，判断采用的方法和条件是否得当，始终以测定酶 活性为标准。
再者，在纯化工作中，往往不宜重复采用相同的步骤和 条件。
最后，要严格控制操作条件。随着酶的逐步纯净，杂蛋 白含量亦逐步降低，蛋白质之间的相互作用力随之下降, 酶更不稳定，因此,更要防止酶变性。
V0 — 原来溶液的体积 V— 所需加入饱和硫酸铵的体积
S1 — 原来溶液的硫酸铵饱和度 S2 — 所需达到的硫酸铵饱和度
加固体（NH4）2SO4 ：
例：某酶制剂厂生产15吨蛋 白酶发酵液，用硫酸铵进行盐析, 要求硫酸铵的饱和度达到40%， 计算需要加入固体硫酸铵多少kg? （25℃）
W=
B（S2 - S1） 1 － AS2
（一）抽提方法 四稀：稀酸、稀碱、稀盐、稀有机溶剂
（二）抽提过程中的注意事项
1、pH值：选择的pH值不超出酶的酸碱稳定范围；
最好远离待抽提酶的等电点。 2、温度：通常控制在0~4℃左右，尤其是采用有机溶剂提取时。 3、抽提液体积（用量）
抽提液的用量一般为含酶原料体积的2~5倍。可一次抽提，也可分几次 反复抽提。 4、为提高酶的稳定性，可以加入适量的保护剂。
2、酸碱变性法：与热变性原理类似，目的酶与杂蛋白的酸 碱稳定性不同，可以调整不同的pH使杂蛋白变性沉淀。
第三节 膜过滤技术在酶分离纯化中的应用
借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不 同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离、提 纯或浓缩的新型分离技术。
膜分离技术已被国际上公认为20世
纪末至21世纪中期最有发展前途，甚
酶分离纯化方法：
现有的纯化方法，都是以酶与杂蛋白在理化性质、稳定 性上的差异以及酶的生物学特性为依据而建立起来的。
分离依据的性质
分离方法
根据分大小、轻重
离心分离、凝胶过滤、膜分离
根据溶解度大小 根据电学性质
盐析沉淀、有机溶剂沉淀、共沉淀、 选择性沉淀、等电点沉淀
离子交换层析、电泳分离
根据稳定性差异 根据亲和作用
3、注意 加酸碱调节pH值时，防止局部酸碱过高。
（三）有机溶剂沉淀法