➢ 目标酶活力测定方法 ➢ 蛋白质纯度检测方法 ➢ 对杂质的分析方法
第二节分离纯化步骤及方法
一、步骤
发酵产品
1、酶的提取
固液分离，破碎，抽 提，浓缩
2、初分离
3、 纯化
精制品
4结晶
保藏
酶分离纯化总体步骤
1、酶液的提取
（1）发酵液的固液分离 （2）细胞破碎
（1）发酵液的固液分离
❖ 常用的分离方法有离心和过滤。 ➢ 离心分离速度快，效率高，操作时卫生条件
转筒真空过滤器
II
1 2
4 III
6 7
5
3
a.转动盘
b.固定盘
I
1－转筒；2－滤饼；3－割刀；4－分配头；5－吸走滤液的真空凹槽； 6－吸走洗水的真空凹槽；7－通入压缩空气的凹槽I－过滤区； II－洗涤脱水区；III－卸渣区
（2）细胞破碎
❖ 按微生物细胞酶的分布分为三类 ❖ 细胞破碎是指通过物理、化学或生物的方法，
❖ 组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的 方法，通常可先用家用食品加工机将组织打 碎，然后再用10000r/min～20000r/min 的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组织 的细胞打碎。
物理破碎
通过各种物理因素 的作用，使组织、 细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。
冻结-融化法 压榨法 渗透压法 超声波破碎法
纯度要求 极高纯度（>99%）
高纯度（95%-99%）
一般纯度（<95%）
用途 医疗用途
理化性质研究
生产抗原
2、明确目标蛋白与主要杂质的性质
❖ 检测目标酶蛋白稳定条件，至少检测pH 值和离子强度两个条件。
❖ 了解目标酶和杂质的性质：分子大小、 等电点、溶解度等。
3、建立分析方法
❖ 选择快速有效的检测方法要了解每个纯化步骤 的效率，应具备以下能力：
❖ 外加酶制剂法：利用各种水解酶，如溶菌酶、 纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等，于37℃， pH8，处理15分钟，可以专一性地将细胞 壁分解。
二、纯化方法
依据性质
溶解度 分子大小
带电特性 吸附特性 对配体分子 的亲和性
方法
用于粗分 盐析、等电点沉淀、
有机溶剂沉淀
透析、超过滤
用于细分 凝胶过滤
电泳、离子交换层析
有机溶剂处理法：可溶解细胞膜上的脂质化合 物，使细胞膜破坏
表面活性剂处理法：能使脂蛋白形成微泡， 使膜的渗透性改变或使之溶解
酶促破碎
通过细胞本身的 酶系或外加酶制 剂的催化作用， 使细胞外层结构 受到破坏，而达 到细胞破碎
自溶法 外加酶制剂法
自溶法：将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适 当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶 （如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞 内含物释放出来。
❖ 渗透压法：先将细胞置于高渗溶液(如蔗糖溶 液)中平衡一段时间后，突然将其转入到低渗 缓冲液和水溶液中，则细胞壁会因渗透压的 突然变化而破碎。此法只适于处理细胞壁比 较脆弱的细胞。
化学破碎
通过各种化学试剂 对细胞膜的作用， 而使细胞破碎
有机溶剂： 甲苯、丙酮 丁醇、氯仿 表面活性剂： Triton曲拉通X、 Tween SDS
第四章 酶制剂的分离纯化
❖ 目的：获得高纯度酶 ❖ 两个基本环节：分离和纯化 ❖ 分离——得到粗酶溶液； ❖ 纯化——得到一定纯度的酶。
第一节 酶分离纯化的策略
（一）基本原则 （二）纯化方法的选择 （三）纯化策略
(一)基本原则：防止酶变性 措施 ➢ 所有操作在低温下进行，4℃左右 ➢ 控制pH值，最好在缓冲溶液中 ➢ 减少泡沫形成，若需搅拌，减慢速度 ➢ 加入金属螯合剂，避免因重金属离子导
使细胞壁或细胞膜破碎，使细胞内的酶得以 释放。对于动植物来源的酶和微生物产胞内 酶的情况，细胞破碎是必要的一步。
1）机械破碎 2）化学破碎 3）酶解破碎 4）物理破碎
机械破碎
通过机械运动产生的剪切 力，使组织、细胞破碎。
DY89-I型 电动玻璃匀浆机
捣碎法 研磨法 匀浆法
细 胞 破 碎 珠
❖ 研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器 中，加入少量石英砂研磨或匀浆。
❖ 反复冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到 －20℃，然后放于室温(或40℃)迅速融化， 如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使 剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。
❖ 超声波处理法：此法是借助超声波的振 动力破碎细胞壁和细胞器。破碎微生物 细菌和酵母菌时，时间要长一些。
❖ 压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细 胞的方法。在1000×105Pa～ 2000×105Pa 的高压下使细胞悬液通过 一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底 破碎。
❖ 加压过滤：是以压力泵或压缩空气为过滤推
动力——板框压滤机 ❖ 加压过滤适合于霉菌、放线菌、酵母菌等发
酵液的过滤。
滤浆
滤液 优点：操作灵活，过滤面积大，可承受较大压力； 缺点：劳动强度大，操作不连续，生产效率低。
❖ 真空过滤：
即通过抽真空的方法使过滤介质上下方之间 产生压差，从而推动液体通过过滤介质，截 留大颗粒的过滤方法——真空转鼓过滤机
吸附层析 亲和层析 金属螯合层析
（1）盐析沉淀法
❖ 定义： 是利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件 下溶解度不同的特性，通过在酶液中添 加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶 液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离的 过程。
❖ 优点： ①成本低，不需要特别昂贵的设备。 ②操作简单、安全，重现性好。 ③大多数酶在高浓度盐中稳定。
缺点： 分辨率差，纯度低，需要脱盐
好等特点，但是设备投资费用高，能耗较大 ➢ 过滤就是用多孔性介质（滤布）截留固态悬
浮液中的固体粒子，进行固液分离的方法。 发酵液粘度不大时采用过滤操作，可实现大 量连续处理。
滤饼过滤
过滤
悬浮液
滤饼
过滤介质
清液
特点：固体颗粒呈饼层状 沉积于过滤介质的上游一
滤饼过滤 侧，形成滤饼层 。
❖ 重力过滤： 重力过滤即常压过滤，主要的 作用力为液体的重力，滤液靠重力作用通过染 ➢ 加入蛋白酶抑制剂，防止水解蛋白质
（二）纯化方法的选择
❖ 评价纯化方法的指标 ➢ 提纯倍数 ➢ 酶活回收率 ➢ 重现性
（三）纯化策略
纯化策略是一个系统化的途径和方法。
❖ 尽量缩减纯化步骤
产 品 获 得 率 %
纯化步骤数
1、设定目标
根据产物的最终用途设定纯度要求