1.18~1.23
1.18~1.26 1.06~1.15 1.14~1.19 1.07~1.16 1.06~1.16
1.19~1.22
n.a. 1.03~1.07 1.12~1.15 1.05~1.12 1.05~1.10
高尔基体（完整）
高尔基体（小泡） 肌质网 叶绿体 植物线粒体
1.05~1.12
以人为例，基因组分析表明，人具有3万~5万个基因，经过剪 切和翻译后修饰产生更多的蛋白质种类；受蛋白质等电点极限、 疏水性、相对分子质量范围以及蛋白质丰度限制，很难由2-DE技 术一步到位地获得生物体的全蛋白质组。
蛋白质的亚细胞定位对蛋白质生物功能的发挥起到 极关键的作用，蛋白质亚细胞定位信息强烈暗示着其 生物学功能。
时间/min
5~10 30 (5) 10~15 10~20 10~20 30~60 30~60 10~15 30~60 30~60 20~30 20~40 20 10 15
14
* 核膜的制备物是否是完整的包膜，它的沉降速率取决于制备的方式。
密度梯度离心 (isodensity centrifugation)
6
二、亚细胞蛋白质组学的意义
1. 富集低丰度蛋白质，完善全细胞蛋白质组
2. 提供蛋白质的亚细胞定位信息 3. 加深对亚细胞组分的结构功能理解 4. 加深对细胞生理分子机制的理解
5. 利于亚细胞蛋白质组的差异表达谱研究
7
三、亚细胞蛋白质组学的技术基础
亚细胞组分的分离纯化 （一）亚细胞组分的分离
蛋白质组学技术研究
RCF/g
500~1 000 2 000 (30 000) 1 000~10 000 6 000~15 000 6 000~15 000 30 000~100 000 50 000~100 000 1 000~3 000 50 000~100 000 50 000~100 000 10 000~20 000 50 000~100 000 10 000~35 000 1 000~2 000 5 000~20 000
力研磨或剪切
2、亚细胞组分的分步分离
差速离心 与密度梯度离心 联用
10
差速离心 (differential centrifugation)
是利用样品中各种组分的沉降系数不同而进行分 离的方法，又称差分离心或差级离心。通常两个组分 的沉降系数差在10倍以上时可以用此法分离。
11
优点：样品处理量较大，可用于大量样品的初
蛋白质在胞浆合成后，须在N端分拣信号 (sorting signal) 的 指引下到达不同亚细胞部位发挥生物学功能。常用于蛋白质亚细 胞预测的各种分拣信号包括：信号肽 (signal peptide, SP)、线粒
体引导肽 (mitochondrial targeting peptide, MTP)、叶绿体运
23
哺乳动物细胞膜的主要酶分布特点
膜成分
细胞膜
顶端膜 基底膜 5’-核苷酸酶、亮氨酸氨肽酶、碱性磷酸酶 Na+/K+-ATP酶、激素控制的腺苷酸环化酶 5’-核苷酸酶、 Na+/K+-ATP酶 琥珀酸脱氢酶 Β-半乳糖苷酶、酸性磷酸化酶、芳基硫酸酯酶 过氧化氢酶、尿酸酶 半乳糖苷转移酶 NADPH (或NADH-)细胞色素c还原酶 核苷酸三磷酸酶
内容物
细胞核，重线粒体，大片细胞膜 重线粒体，细胞膜碎片
线粒体，溶酶体，过氧化物酶体，完整高尔 基体
线粒体，溶酶体，过氧化物酶体，高尔基体 溶酶体，过氧化物酶体，高尔基体膜，大的 高密度小泡（如粗面内质网） 从内质网而来的所有小泡，细胞膜，高尔基 体，核内体等
注：RCF即相对离心力。
13
细胞器的大小和沉降特性
线粒体蛋白质
分泌蛋白 核蛋白质
识别MTP
识别SP 识别NLS
Predotar
TMHMM HMMTOP SobLoc NNPSL
http://www.inra.fr/Internet/Produits/Predotar
http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHM-2.0 http://www.enzim.hu/hmmtop/ /SubLoc /nnpsl
亚细胞成分
细胞核
密度/（g· cm-3）
蔗糖
>1.30
低渗透压介质*
1.21~1.24
核膜
线粒体 Mitoplast 线粒体质 溶酶体
1.18~1.22
1.17~1.21 1.44 1.19~1.21
n.a.
1.15~1.20 n.a. 1.10~1.15
过氧化物酶体
粗面内质网 光面内质网 细胞膜 大片 小片 核内体
等密度区带离心法是根据样品组分的密度差别
进行分离纯化。
16
密度梯度离心介质
蔗糖梯度
便宜，溶解度高，能够制备分离绝大多数成分所要求的密度范围的溶液， 最常用；
高浓度时黏性大，且渗透压高。
Ficoll Percoll Nycodenz Metrizoate
17
亚细胞成分在蔗糖和低渗透压介质中的密度
亚细胞成分
细胞核 核膜* 线粒体 溶酶体 过氧化物酶体 粗面内质网小泡 光面内质网小泡 胞膜 大片 小泡 核内体 高尔基体(完整) 高尔基体(小泡) 肌质网 叶绿体 植物线粒体
大小/μm
4~12 0.4~2.5 0.4~0.8 0.4~0.8 0.05~0.35 0.05~0.3 3~20 0.05~2.0 0.05~0.4 1.0~2.0 0.05~0.5 0.1~1.0 2~5 1~3
Western blot TAP (tandem
affinity purification)
电镜技术 荧光显微镜技术
endoБайду номын сангаас-YFP
(apoptotic endonuclease)
Mitochondria Co-localization
26
（四）蛋白质亚细胞定位预测技术
亚细胞定位预测主要基于蛋白质氨基酸序列的三个 方面的特性：氨基酸组成特点、分拣信号的识别以及氨 基酸序列的进化保守性。
亚细胞蛋白质组学
基础医学院 病理生理学教研室
刘 芸
1
授课提纲
第一节
第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 第七节
概论
细胞膜的蛋白质组学研究进展 高尔基体蛋白质组学研究进展 核孔复合体蛋白质组学研究进展 核仁蛋白质组学研究进展 线粒体蛋白质组学研究进展 展望
2
第一节 概论
真核生物体是一个复杂系统。
1.05~1.12 1.04~1.08 1.18~120 1.16~1.19
1.03~1.08
1.03~1.08 n.a. 1.10~1.13 n.a. 18
注：n.a. 为未得到数据； * 这些数据是在Nycodenz、 Metrizoate或Percoll中的密度。
（一）亚细胞组分的分离
3、免疫共沉淀法 (Co-IP) 分离信号复合体
4类亚细胞定位
12种亚细胞定位
SignalP、ChloropP和 MTP识别三者相结合
氨基酸组成与分拣 信号识别相结合
注：CTP 叶绿体运输肽 (chloroplast transit peptide) ; NLS 核定位信号 (nuclear localization signals); MTP 线粒体引导肽 (mitochondrial targeting peptide); SP 信号肽 (signal peptide)。 28
(Signaling complex )
19
基本原理：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整
细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留 了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在 体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
Y X
agarose
G
agarose
G
agarose
G
20
实验设计思路
21
5
一、亚细胞蛋白质组学的内涵
大分子结构体 (macromolecular structure)或多 蛋白质复合体 (multiprotein complex)
如核基质 (nuclear matrix)、剪接体 (spliceosome )、纺锤体 (spindle pole)、核孔结构 (nuclear pore complex)以及核糖体 (ribosome)等。
又称为区带离心，是将样品溶液臵于一个由梯度材 料形成的密度梯度液体柱中，离心后被分离组分以区 带层分布于梯度柱中。按照离心分离原理，梯度离心 又可分为速率区带离心法 (又称连续密度梯度离心法)和 等密度离心法 (又称不连续密度梯度离心法)。
15
速率区带离心法是根据样品中不同组分粒子
所具有的不同体积尺寸大小和不同沉降系数进行分离。
（一）亚细胞组分的分离
4、亲和层析法分离不同亲和特性的亚细胞组分
根据细胞或亚细胞组 分中不同种类的翻译后修 饰特性可望用来分离各类 被修饰的蛋白质。
22
（一）亚细胞组分的分离
5、分离纯化效果的评价
判断亚细胞分离纯化是否成功，可以用光学或电子
显微镜监测，或者检测蛋白质浓度或合适的标志酶。
纯化过程中跟踪合适的标志酶的活性可以确定目的细胞器 的产率和污染其他细胞器成分的程度。 通过在纯化过程中确定蛋白质的浓度，计算每一步的比活性 （活性与蛋白质的比率），可以用来估算富集程度或纯化倍 数。
预测功能
叶绿体蛋白质
预测依据
识别CTP
MitoProt
SignalP predictNLS
http://www.mips.biochem.mpg.de/cgi-bin/proj /medgen/mitofilter