基因敲除技术的最新进展　yunfenglin干细胞与组织工程讨论版　【摘要】　自从上世纪80年代初的胚胎干细胞技术的成熟，在短短的20年里，关于基因敲除动物模型的报道呈几何数增长。

现在的技术已经可以产生在时间和空间上都可以人为控制的，从点突变到染色体组大片段的删除和重排的各种基因突变小鼠，这样就可以让研究每个基因的具体功能成为可能。

本文将首先简介基因敲除技术的技术背景、基本原理、基本步骤；然后将重点介绍现在基因敲除的常用策略及其利弊；接着将探讨基因打靶结果不理想的常见因素，包括基因背景、基因重复、基因补偿、和基因补充；最后介绍基因打靶技术的技术热点，包括组织特异性打靶、诱导性打靶。

并探讨基因打靶技术在颌面外科的应用前景。

【关键词】基因敲除、条件性基因打靶、组织特异性基因打靶、诱导性基因打靶技术背景基因打靶技术是20世纪80年代发展起来的[1]，是建立在基因同源重组技术基础以及胚胎干细胞技术基础上的一种新分子生物学技术。

所谓胚胎干细胞(Embryonic Stem cell，ES)是从着床前胚胎(孕3—5天)分离出的内细胞团(Inner cell mass，ICM)细胞[2]，它具有向各种组织细胞分化的多分化潜能，能在体外培养并保留发育的全能性。

在体外进行遗传操作后，将它重新植回小鼠胚胎，它能发育成胚胎的各种组织。

而基因同源重组是指当外源DNA片段大且与宿主基因片段同源性强者并互补结合时，结合区的任何部分都有与宿主的相应片段发生交换(即重组)的可能，这种重组称为同源重组。

[3]基因打靶就是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的的一种技术[4]。

它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。

这项技术的诞生可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命。

尤其是条件性、诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明确、效果更加精确、可靠，它的发展将为发育生物学、分子遗传学、免疫学及医学等学科提供了一个全新的、强有力的研究、治疗手段，具有广泛的应用前景和商业价值。

现在基因敲除技术主要应用于动物模型的建立，而最成熟的实验动物是鼠，对于大型哺乳动物的基因敲除模型还处于探索阶段。

２０００年初的敲除了决定表面抗原的猪的模型的成功建立更是为异种器官移植排除了一道重要的障碍，展示了基因敲除技术的美好前景。

基本步骤利用基因打靶技术产生转基因动物的程序一般为：ａ．ES细胞的获得：现在基因敲除一般应用于鼠，而最常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。

而其他遗传背景的胚胎干细胞系逐渐被发展应用，最近来自于C57BL/6×CBN/JNCrj F1小鼠的胚胎干细胞系成功地用于基因敲除。

c57BL／6小鼠种系等已经广泛的应用于免疫学领域，并以此为背景建立了许多成功的转基因模型。

[5,9,11]ｂ．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因(如neo基因，TK基因等)的载体上，此重组载体即为打靶载体。

因基因打靶的目的不同，此载体有不同的设计方法，可分为替换性载体和插入型载体[6,7]。

如为了把某一外源基因引入染色体DNA的某一位点上，这种情况下应设计的插入型载体要包括外源基因(即目的基因)、同源基因片段及标记基因等部分。

如为了使某一基因失去其生理功能，这时所要设计的替换型打靶载体，应包括含有此靶基因的启动子及第一外显子的DNA片段及标记基因等诸成分。

ｃ．将基因打靶载体通过一定的方式(常用电穿孔法)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将打靶载体中的DNA序列整合到内源基因组中从而得以表达[7,8]。

一般地，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用。

ｄ．用选择性培养基筛选已击中的细胞：一般地，筛选使用正、负选择法，比如用G418筛选所有能表达neo基因的细胞，然后用Ganciclovir淘汰所有HSV-TK正常表达的细胞，剩下的细胞为命中的细胞。

将筛选出来的靶细胞导入鼠的囊胚中，再将此囊胚植人假孕母鼠体内，使其发育成嵌合体小鼠。

ｅ．通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。

[5,9]基因打靶技术的新进展ａ．条件性打靶条件性基因打靶(conditional gene targeting)可定义为将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因打靶方法[5]。

它实际上是在常规的基因打靶的基础上，利用重组酶介导的位点特异性重组技术，在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一个可调控的“按钮”，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。

利用Cre／LoxP和来自酵母的FLP—frt系统可以研究特定组织器官或特定细胞中靶基因灭活所导致的表型[10]。

通过常规基因打靶在基因组的靶位点上装上两个同向排列的1oxP，并以此两侧装接上loxP的(“loxP floxed”)ES细胞产生“loxPfloxed”小鼠,然后，通过将“loxP floxed”小鼠与Cre转基因鼠杂交(也可以其他方式向小鼠中引入Cre重组酶)，产生靶基因发生特定方式(如特定的组织特异性)修饰的条件性突变小鼠。

在“loxP floxed”小鼠，虽然靶基因的两侧已各装上了一个loxP，但靶基因并没有发生其他的变化，故“1oxP noxed”小鼠表型仍同野生型的一样。

但当它与Cre转基因小鼠杂交时，产生的子代中将同时带有“loxP floxed”靶基因和Cre基因。

Cre基因表达产生的Cre重组酶就会介导靶基因两侧的1oxP间发生切除反应，结果将一个loxP和靶基因切除。

这样，靶基因的修饰(切除)是以Cre的表达为前提的。

Cre的表达特性决定了靶基因的修饰(切除)持性：即Cre在哪一种组织细胞中表达，靶基因的修饰(切除)就发生在哪种组织细胞；而Cre的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率。

所以只要控制Cre的表达特异性和表达水平就可实现对小鼠中靶基因修饰的特异性和程度[11]。

ｂ．诱导性打靶诱导性基因打靶就是以Cre/loxp系统为基础、利用控制Cre表达的启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用Cre基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性、从而在1oxP动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因打靶技术。

人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计的方式来对动物基因突变的时空特异性进行人为控制、以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。

常见的几种诱导性打靶类型如下：四环素诱导型；干扰素诱导型；激素诱导型；腺病毒介导型。

其优点有：①诱导基因突变的时间可人为控制；③可避免因基因突变而致死胎的问题②在2个loxP位点之间的重组率较高；①如用病毒或配体／DNA复合物等基因转移系统来介导Cre的表达，则可省去建立携带Cre的转基因动物的过程。

如果在Cre—ERT和Ad—Cre表达系统中采用组织细胞特异的启动子来控制Cre的表达，其诱导的基因重组的组织细胞特异性还可进一步提高[12]。

c.基因捕获技术用常规方法进行基因打靶研究需耗费大量的时间和人力，研究者必须针对靶位点在染色体组文库中筛选相关的染色体组克隆，绘制相应的物理图谱，构建特异性的打靶载体以及筛选中靶ES细胞等，通常一个基因剔除纯合子小鼠的获得需要一年或更长的时间。

面对人类基因组计划产生出来的巨大的功能未知的遗传信息，传统的基因敲除方法显得有些力不从心。

因此，基因捕获法应运而生，利用基因捕获可以建立一个携带随机插入突变的ES细胞库，节省大量筛选染色体组文库以及构建特异打靶载体的工作及费用，更有效和更迅速地进行小鼠染色体组的功能分析。

典型的基因捕获载体包括一个无启动子的报道基因，通常是neo基因，neo基因插入到ES细胞染色体组中，并利用捕获基因的转录调控元件实现表达的ES克隆可以很容易地在含G418的选择培养基中筛选出来，从理论上讲，在选择培养基中存活的克隆应该100％地含有中靶基因。

中靶基因的信息可以通过筛选标记基因侧翼cDNA 或染色体组序列分析来获得[13]。

用基因捕获法在单次实验中可以获得数以百计的带有单基因剔除的ES克隆。

这些克隆可以在96孔培养板中生长、复制并用于基因型分析，大规模地保存和分析中靶ES细胞在小型的实验室中也是可行的。

此方法的缺点是只能剔除在Es细胞中表达的基因．单种的细胞类型中表达的基因数目约为I04，现在的基因捕获载体从理论上来讲应能剔除所有在ES 细胞表达的基因，因此，在ES细胞中进行基因捕获还是大有可为的。

1997年后，克隆技术接连取得重要突破，用哺乳动物体细胞可以克隆出新个体。

可以设想，在体细胞中应用基因捕获可以剔除更多在发育晚期才表达的基因，其后通过核移植技术获得带有突变基因的动物个体、这不失为一种可以弥补以上缺陷的办法。

用基因捕获法进行基因剔除的另一个缺点是无法对基因进行精细的遗传修饰，基因打靶技术在颌面外科领域的应用前景基因打靶技术的前景和展望：基因打靶技术是80年代后期发展起来的新兴的分子生物学技术，它具有定位性强、打靶后新的基因随染色体DNA稳定遗传的特点。

它是一种理想的修饰改造生物遗传物质的方法．这项新的技术无论在基础理论研究领域还是在实际应用中都有着美好而广阔的前景。

细菌的基因工程技术是本世纪分子生物学史上的一个重大突破，而基因打靶技术则是遗传工程中的另一重大飞跃。

基因打靶技术使人们有可能真正地按自己的设想去改造生物的遗传物质，且使改造后的遗传物质能稳定遗传。

一些复杂的生命现象如发育的分子机制有望通过此技术得以解答。

人们可使用此技术创造出更多有利于人类的新品种[15]。

人们可望利用这一技术解决某些遗传病的治疗问题，人们也可望通过这一技术更多更深地解决一些疾病的分子机理问题。

而对于颌面外科的发展同样具有美好的前景[16]。

对颌面发育畸形的认识和治疗带来根本性的改变发生于口腔颌面外科的遗传性疾病，比如唇、面、腭裂等的发病原因等都还有待解决，而遗传在其中扮演了什么样的角色还急待研究，随着人类基因组的全部破译，基因敲除技术对于决定颌面部发育的基因的功能研究和日后的基因治疗都具有重大的意义[14]。

对头颈部肿瘤的发生和治疗将带来新的研究和治疗手段肿瘤一直是人类迫切希望攻克的难关，而肿瘤的发病原因一直未能得到满意的解释，随着基因治疗的发展，了解和肿瘤相关的基因的功能及如何修复突变基因更是肿瘤学的研究热点，而基因打靶技术将是一把有力的利剑，为肿瘤的研究和治疗带来革命性的变化。