双酶切位点,有利于定向克隆, 2-3个保护碱基,一般加CG.计 算引物Tm 值时并不包括这些序 列,但是应该对其进行互补性和 内部二级结构的检测.
引物的内部稳定性
过去认为,引物3'端应牢牢结合在模板上才 能有效地进行延伸,故3'端最好为G或C. 现在的观点认为,引物的5'端应是相对稳定 结构,而3'端在碱基配对的情况下最好为低 稳定性结构,即3'端尽可能选用A或T(有说 不适宜用A),少用G或C.
自由能分布
G 值是指DNA 双链形成所需的自由能,该值反映了双链结构 内部碱基对的相对稳定性(结合的强弱程度 结合的强弱程度). 结合的强弱程度 一般情况下,引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状, 一般情况下,引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状,即5'端和中 ΔG值最好呈正弦曲线形状 ΔG值较高 值较高, ΔG值相对较低 且不要超过9 值相对较低, 间ΔG值较高,而3'端ΔG值相对较低,且不要超过9 (绝对值, 一般考虑末端5个碱基的G.此值的大小对扩增有较大的影响, 负值大,则3'末端稳定性高,扩增效率更高,同时也更易于异 位引发.因此在复杂模板的扩增体系中,3'末端5聚体的G应 大于-9.0kcal/mol) ,如此则有利于正确引发反应而可防止错 误引发. 误引发.引物的3'端的G 值过高,容易在错配位点形成双链 结构并引发DNA 聚合反应.(能值越高越容易结合)
端可适当放宽) 端可适当放宽
引物3'端
引物的延伸从3'端开始,因此3'端的几 个碱基与模板DNA均需严格配对,不能进 行任何修饰,否则不能进行有效的延伸, 甚至导致PCR扩增完全失败. PCR
引物3'端的碱基一般不用 ( 端碱基序列最好是 端碱基序列最好是G, , 引物 '端的碱基一般不用A(3'端碱基序列最好是 ,C, CG,GC).另外引物间 '端的互补,二聚体或发夹结 , ) 另外引物间3'端的互补, 构也可能导致PCR反应失败. 反应失败. 构也可能导致 反应失败 3'端的连续3个G 或C ,如GGG或CCC,会导致引物在G+C富 '端的连续3 G+C富 或 ,会导致引物在G+C 集序列区错误引发
4,质粒作图
Gene Construction Kit WinPlas 2.7 Plasmid Premier2.02 Plasmid Toolkit
5,结构域(motif)查找
推荐软件:Primer Premier 5.0 Primer Premier 5.0的结构域查找功能与它 的引物设计一样强,结果能以图形,表格, 序列三种方式输出.同时还提供了一些未知 的结构域的列表;当然软件本身也提供了大 量的已知结构域的序列.
引物5'端
引物5'端可以有与模板DNA不配对碱基(对PCR 影响不大) 影响不大),常在5'端引入修饰位点或标记物.
5'端加上限制性核酸内切酶位点序列(酶切位点5' 端加上适当数量的保护碱基). 5'端的某一位点修改某个碱基,人为地在产物中引 入该位点的点突变以作研究. 5'端标记放射性元素或非放射性物质(如生物素, 地高辛等).
两引物之间不应该存在互补性,尤应避免 端的互补重叠以防引物二聚体的形成 端的互补重叠以防引物二聚体的形成. 两引物之间不应该存在互补性,尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成.一 般情况下,一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性 个连续碱基的同源性或互补性. 般情况下,一对引物间不应多于 个连续碱基的同源性或互补性.
2,引物设计
Oligo 6 (引物评价)* Primer Premier (自动搜索)* Vector NTI Suit (综合分析) Primer Express(实时定量PCR引物和探针设计) Omiga Dnastar Primer3 (在线服务)*
3,同源序列比较
NCBI的BLAST; ExPASy的Alignment GeneDoc 3.2 Clustal X Vector NTI Omiga,Bioxm ,LaserGene,pcgene等
概述
引物长度
一般引物的长度为15bp,常用的长度为18 21bp 18- bp. 一般引物的长度为15-30 bp,常用的长度为18-21bp. 15 过长或过短都不合适, 过长或过短都不合适,为过长会导致其延伸温度大于 74℃,不适于Taq DNA聚合酶进行反应 长度大于24 聚合酶进行反应, 74℃,不适于Taq DNA聚合酶进行反应,长度大于24 核苷的引物并不意味着更高的特异性,而且比短序列 核苷的引物并不意味着更高的特异性, 杂交慢,从而降低了产量.引物过短会引起错配现象, 杂交慢,从而降低了产量.引物过短会引起错配现象, 一般来说引物长度大于16bp是必要的( 一般来说引物长度大于16bp是必要的(18bp的序列在 16bp是必要的 的序列在 人类基因组中只会出现一次). 人类基因组中只会出现一次).
1,限制酶分析
推荐软件:
DNAssist 1.0
大多软件只对线性序列进行分析,那么cNNNNN……… NNNgaatt环状的序列就找不到EcoR I的位点,DNAssist 1.0能很容易把这个EcoR I位点找出来. 另外DNAssist在输出上非常完美,除了图形,线性显示 外,还有类似DNASIS的列表方式,列出所有的位点(按 酶排列,按碱基顺序排列) 另外,Vector NTI 亦是一选择
有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高,导致引物的 含量偏低或偏高,导致引物的GC含量不能在上述范围 有一些模板本身的 含量不能在上述范围 这时应尽量使上下游引物的GC 含量以及 含量以及Tm 值保持接近(上下游引物的 值保持接近( 内,这时应尽量使上下游引物的 GC含量不能相差太大),以有利于退火温度的选择. 含量不能相差太大) 以有利于退火温度的选择. 含量不能相差太大
常用生物软件及使用概述
也许不必将它当成您的研究领域 但您最好知道如何使用这个工具
一,管理实验室数据及文献资料 一,管理实验室数据及文献资料
查阅实验相关文献, 查阅实验相关文献,以便对自己所要做课题的最新进展有 一个基本的了解,从而确定自己的实验策略;同时,方 便实验室结果的储存,管理和申报工作.常用软件: 1,Reference Manager (可以在线通过查找关键词搜索 PubMed等多个数据库中的专业资料, PubMed等多个数据库中的专业资料,同时保存查找的资料 为本地文件. ) 2, Endnote(一个在线专业资料查找系统,可以保存查找 (一个在线专业资料查找系统, 资料,并在文章中对引用格式化. 资料,并在文章中对引用格式化. ) 3,医学文献王(特长在中文期刊的系统化,也支持外文 医学文献王(特长在中文期刊的系统化,也支持外文 文献数据库)引发效率(引物唯一性)
选用的引物序列就应当是唯一的,即在模板中没有重 复序列 好的设计工具会提供一个引物异位引发的评价指标, 好的设计工具会提供一个引物异位引发的评价指标, efficiency, 如Oligo 6.0 的false priming efficiency,即异位引发 效率,这个值是由程序根据引物自身二级结构的能量, 效率,这个值是由程序根据引物自身二级结构的能量,错 配的类型,错配离3'末端的距离等因素综合计算而得出, 配的类型,错配离3'末端的距离等因素综合计算而得出, 3'末端的距离等因素综合计算而得出 当此值大于200时便很有可能引发扩增. 当此值大于200时便很有可能引发扩增.如所用工具无量 200时便很有可能引发扩增 化指标,则可依据经验,当引物与模板在非预期位置退火, 化指标,则可依据经验,当引物与模板在非预期位置退火, 超过70%的碱基能互补配对,或引物3 末端连续8 超过70%的碱基能互补配对,或引物3'末端连续8个或以 70%的碱基能互补配对 上碱基配对,则认为有引发的可能. 上碱基配对,则认为有引发的可能.
6,RNA二级结构预测 二级结构预测
RNAdraw RNAStructure
7, 蛋白分析 软件
二级结构分析 :Antheprot 4.5 RasMol 三维结构显示 :RasMol Cn3D
8, 格式转换
各种软件为了自己软件的需要有不同的格式, 对我们使用数据带来了困难;格式转换软件 能帮助用户解决这一问题. 推荐软件:Seqverter 1.3 使用简单,填写输入文件和输出文件名就可 以完成格式转换.而且能够转换的格式非常 之多是其它软件所无法比拟的.另外,它可 在线升级以读写更多格式文件.
引物Tm值
一般要求:55℃-65℃. 应尽可能保证上下游引物Tm值一致,一般差异控 引物的退火温度相差小于5℃ 制在2 ℃以内. (引物的退火温度相差小于 ℃一般不会影响
PCR的产率,理想情况下一对引物的退火温度是一样的,可以在 的产率,理想情况下一对引物的退火温度是一样的, 的产率 55℃～80℃间变化,有说接近 ℃为最佳) ℃ ℃间变化,有说接近72℃
3′末端双链的ΔG是 ～-2 kcal/mol时 PCR产量几乎达到百分之百 产量几乎达到百分之百, 3′末端双链的ΔG是0～-2 kcal/mol时,PCR产量几乎达到百分之百,随 末端双链的ΔG 着其绝对值的增加产量逐渐下降, 时只有40% 40%, 时少于20% 20%, 着其绝对值的增加产量逐渐下降,在-6时只有40%,到-8时少于20%,而 10时接近于 时接近于0 -10时接近于0.
上下游引物Tm值与产物Tm值一般应控制在20 ℃ 以内. 一般采用较低引物Tm值-5℃作为PCR退火温度.
一对引物的GC含量和 值应该协调.若是引物存在严重的 含量和Tm值应该协调 若是引物存在严重的GC倾向或 倾向则可以 值应该协调. 倾向或AT倾向则可以 一对引物的 含量和 倾向或 在引物5'端加适量的A, 或 , 尾巴 尾巴. 含量太低, 端加上一些G或 , 在引物 '端加适量的 ,T或G,C尾巴.若G+C含量太低,可在 端加上一些 或C, 含量太低 可在5'端加上一些 含量太高, 端加上一些A或 . 若G+C含量太高,可在 端加上一些 或T. + 含量太高 可在5'端加上一些