微生物测试作业指导书编制：岗位：理化工程师签字：日期：审核：岗位：理化主管签字：日期：批准：岗位：质量经理签字：日期：1.目的：为了对口罩产品和初包装材料的微生物限度和控制菌进行有效控制且满足相应销售区域的标准,特制定本测试作业指导书。
2.范围：适用于本公司口罩产品及初包装材料的微生物检测。
3.职责3.1 质量部负责按照本规程的要求对初包装材料的微生物限度以及口罩产品的细菌、真菌总数和控制菌（大肠菌群、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌）进行检验，并出具判定报告。
3.2质量部负责定期对检测结果进行汇总及趋势分析。
3.3质量部负责本文件的编制、审核、批准。
4.工作程序4.1 测试标准：●YY 0469-2011医用外科口罩●GB 19083-2010 医用防护口罩技术要求●GB 15979-2002一次性使用卫生用品卫生标准●EN 14683:2019 Medical face masks-Requirements and test methods●《中国药典2015版四部》4.2样品的取样数量：对于符合GB 19083-2010、YY 0469-2011和YY /T 0969-2013的口罩产品，取同一生产批的4个样品用于检测。
对于符合EN 14683:2019的口罩产品，取同一生产批的5个样品用于检测。
4.3控制标准：4.3.1产品相关控制标准医用防护口罩（GB 19083-2010）：医用外科口罩（YY 0469-2011）和一次性使用医用口罩（YY /T 0969-2013）：医用口罩（EN 14683:2019）微生物限度标准：≤30cfu/g4.3.2初包装材料微生物控制标准5.检测方法5.1 检测前准备5.1.1培养基a)需从合格供应商处购置成品培养基，作为支持微生物生长繁殖或新陈代谢产物的营养基础。
b)配置前需检查培养基名称和批号，打开后观察有无大型结块和污染。
如果出现上述现象不得使用。
c)成品培养基的配置参照培养基瓶身上的配置说明进行操作。
d)培养基湿热灭菌后待冷却到40-50℃，备用。
配制好的培养基，现配现用。
5.2实验设备及器材（器材需灭菌后使用）5.2.1设备：摇床，电子天平5.2.2器材：a)剪子；b)镊子；c)薄膜过滤器；d)容器（根据实验条件选取合适容器）；5.2.3缓冲液：0.9%氯化钠溶液（适用于符合YY 0469-2011和GB 19083-2010的产品）浸提液（适用于符合EN 14683:2019的产品）：1 g/l 蛋白胨, 5 g/l 氯化钠和 2 g/l吐温20。
5.3微生物限度检测5.3.1实验前准备：将实验器材、实验样品、缓冲液等经实验室传递窗消毒后转入实验室操作台摆放好。
试验前，需确认供试品初包装包装完好、无破损、封口处无开封等现象。
否则不予试验。
5.3.2适用于符合GB 19083-2010的产品的微生物限度检测5.3.2.1试验方法：在100级净化条件下用无菌方法打开用于检测的4个样品，准确称取10g±1g样品，剪碎后加入到200mL灭菌生理盐水中，充分混匀，得到一个生理盐水样液。
●细菌菌落总数检测方法：待上述生理盐水样液自然沉降后取上清液作菌落计数。
共接种5个平皿，每个平皿中加入1 mL样液，然后用冷却至45℃左右的熔化的营养琼脂培养基倒入5个平皿内15～20mL混合均匀，待琼脂凝固后翻转平皿置35℃±2℃培养48h后，计算平板上的菌落数。
取1mL灭菌生理盐水加入到一个空白平皿内，注入15～20mL的熔化的营养琼脂，待琼脂凝固后翻转平皿置35℃±2℃培养48h后应无菌生长，作为阴性对照。
●真菌菌落总数检测方法：待上述生理盐水样液自然沉降后取上清液作真菌计数，共接种5个平皿，每一个平皿中加入1ml样液，然后用冷却至45℃左右的熔化的沙氏琼脂培养基15-25ml倒入每个平皿内混合均匀，琼脂凝固后翻转平皿置25℃±2℃培养7天，分别于3、5、7天观察，计算平板上菌落数，如果发现菌落蔓延，以前一次的菌落计数为准。
取1mL灭菌生理盐水加入到一个空白平皿内，注入15～20mL的熔化的沙氏琼脂培养基，待琼脂凝固后翻转平皿置25℃±2℃培养7天后应无菌生长，作为阴性对照。
5.3.2.2菌落计数方法a.观察菌落生长情况，点计平板上生长的所有菌落数；计数并报告。
菌落蔓延生长成片的平板不易计数，需重新取样进行试验。
b.若平板皿上有2个或以上的菌落重叠，可分辨时仍以2个或2个以上的菌落计数；产品测试后，点记菌落数后，再依照计算公式算出细菌总数，公式如下：X1=A∗K5式中: X1一一细菌菌落总数，cfu/g；A一一5块营养琼脂培养基平板上的细菌菌落总数；单个培养皿上菌落数表示以AnK一一稀释度；依照计算公式算真菌总数，公式如下：X2=B∗K5式中: X2一一真菌菌落总数，cfu/g；A一一5块沙氏琼脂培养基平板上的真菌菌落总数；单个培养皿上菌落数表示以BnK一一稀释度5.3.3适用于符合YY 0469-2011或YY /T 0969-2013的产品的微生物限度检测5.3.3.1试验方法在100级净化条件下用无菌方法打开用于检测的4个样品，准确称取10g±1g样品，剪碎后加入到200mL灭菌生理盐水中，充分混匀，得到一个生理盐水样液。
细菌菌落总数检测方法：待上述生理盐水样液自然沉降后取上清液作菌落计数。
共接种5个平皿，每个平皿中加入1 mL样液，然后用冷却至45℃左右的熔化的营养琼脂培养基倒入5个平皿内15～20mL混合均匀，待琼脂凝固后翻转平皿置35℃±2℃培养48h后，计算平板上的菌落数。
取1mL灭菌生理盐水加入到一个空白平皿内，注入15-20mL的熔化的营养琼脂，待琼脂凝固后翻转平皿置35℃±2℃培养48h后应无菌生长，作为阴性对照。
5.3.3.2菌落计数方法a.观察菌落生长情况，点计平板上生长的所有菌落数；计数并报告。
菌落蔓延生长成片的平板不易计数，需重新取样进行试验。
b.若平板皿上有2个或以上的菌落重叠，可分辨时仍以2个或2个以上的菌落计数；产品测试后，点记菌落数后，再依照计算公式算出细菌总数，公式如下：X1=A∗K5式中: X1一一细菌菌落总数，cfu/g；A一一5块营养琼脂培养基平板上的细菌菌落总数；单个培养皿上菌落数以A表示nK一一稀释度；5.3.4适用于符合EN 14683:2019的产品的微生物限度检测5.3.4.1 实验方法●取样用于测试的口罩样品应包装在提供给最终用户的原始初级包装中提供。
当选择5个样本时，取顶部、底部和3个随机选择的口罩。
如果口罩包含其他附件，则应包括在测试中。
●测试将所有口罩无菌地从包装中取出，剪碎后称重，再放入装有300mL浸提液（1克/升蛋白胨、5克/升氯化钠和2克/升吐温20）的均质袋内。
含有样品的均质袋被放置在一个轨道摇床上，并在250rpm振摇5min。
在此浸提之后，100mL的浸提液通过0.45μm薄膜过滤，再另取100ml浸提液冲洗滤膜，将滤膜正面向上放置在胰酪大豆胨琼脂培养基平板上进行需氧菌总数计数。
取100mL相同浸提液以相同方式过滤，将滤膜正面向上放置在沙氏葡萄糖琼脂平板上进行真菌总数计数。
取100ml未接触过样品的浸提液过滤，再另取100ml浸提液冲洗滤膜，将滤膜贴于TSA平板表面，另取100ml未接触过样品的浸提液过滤，将滤膜贴于沙氏葡萄糖琼脂表面作为阴性对照。
胰酪大豆胨琼脂培养基平板在(30～35)℃培养3天，沙氏葡萄糖琼脂在(20～25)℃培养7天。
5.3.4.2菌落计数方法a.观察菌落生长情况，点计平板上生长的所有菌落数；计数并报告。
菌落蔓延生长成片的平板不易计数，需重新取样进行试验。
b.若平板皿上有2个或以上的菌落重叠，可分辨时仍以2个或2个以上的菌落计数；产品测试后，点记菌落数后，再依照计算公式算出细菌总数，公式如下：X=(A+B)∗3/G式中: X1一一菌落总数，cfu/g；A一一TSA平板上的细菌菌落总数；B一一SDA平板上的细菌菌落总数；G一一实验使用的5个口罩的重量。
5.3.5初包装材料微生物检测5.3.5.1 样品种类目前，所需检测的包材类型包括袋（纸塑袋或塑料袋）和卷材。
5.3.5.2 实验方法●袋类包装材料（纸塑袋或塑料袋）：将4个袋类包材以无菌手段取出，放入灭菌容器中，每个包材内加入100ml的0.9%无菌氯化钠溶液，放置摇床上震荡10min（频率为仪表盘显示250）作为供试液；每200ml供试液倒入1个薄膜过滤器中，经薄膜过滤器滤净，使用100ml0.9%无菌氯化钠溶液的冲洗滤膜；测试过程中，应持续保持无菌手段，避免污染检品。
所得滤膜一个放在胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，一个放在沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上。
●卷材：将卷材以无菌手段取出，取相当于2个成品包装大小的卷材，剪碎后放入灭菌容器内，加入200ml0.9%无菌氯化钠溶液；另取相当于2个成品包装大小的卷材，剪碎后放入灭菌容器内，加入200ml0.9%无菌氯化钠溶液。
放置摇床上震荡10min（频率为仪表盘显示250）作为供试液；每200ml供试液倒入1个薄膜过滤器中，经薄膜过滤器滤净，使用100ml0.9%无菌氯化钠溶液的冲洗滤膜；测试过程中，应持续保持无菌手段，避免污染检品。
所得滤膜一个放在胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，一个放在沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上。
●阴性对照：取100ml0.9%无菌氯化钠溶液（未接触样品）经薄膜过滤器过滤，再另取100ml0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜。
将滤膜贴于一个胰酪大豆胨琼脂培养基平板上；同法在制备一个沙氏葡萄糖琼脂平板阴性对照。
●培养温度和培养时间：胰酪大豆胨琼脂培养基平板在(30～35)℃培养3～5天，沙氏葡萄糖琼脂在(20～25)℃培养5～7天。
5.3.5.3菌落计数方法c.观察菌落生长情况，点计平板上生长的所有菌落数；计数并报告。
菌落蔓延生长成片的平板不易计数，需重新取样进行试验。
d.若平板皿上有2个或以上的菌落重叠，可分辨时仍以2个或2个以上的菌落计数；产品测试后，点记菌落数后，再依照计算公式算出菌落总数，公式如下：⁄X=(A+B)2式中: X1一一菌落总数，cfu/g；A一一TSA平板上的细菌菌落总数；B一一SDA平板上的细菌菌落总数；5.3.6检测结果判定a.如果检测结果在控制值内，则判定为合格，并填写实验报告。
b.如果样品菌落总数超过本标准的规定，则判定被检样品不合格。
5.3.7检测结果分析a.检验员根据日常监测结果，对产品初始污染菌检测结果进行汇总及趋势分析，并填写“产品初始污染菌检测趋势分析报告”。
b.“产品初始污染菌检测趋势分析报告”以半年为一个周期，对一个周期内的结果进行分析：若检测结果均正常，应在报告内对周期内的结果进行总结。