体外培养细胞转化
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第二节 诱变因素的选择
本节内容: 一、诱变剂的选择 二、细胞的选择 三、目前常用的细胞种类
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一、诱变剂的选择
要根据体外培养的细胞而定，这可能与细胞对某种诱变剂 的敏感及其特异受体的存在有关，因此，实验时要根据细 胞特性来选择合适的诱变剂。
第12章 体外培养细胞的转化
体外培养的细胞，有时会发生自发转化，但 这种自发产生的转化时间长，转化率极低， 需用大量细胞，必须用人工诱发的方法。
人工诱发体外培养细胞转化，转化细胞所需 时间短，转化率较高，这对研究癌变原理， 研究可疑致癌因素的作用有很大的实用价值。
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第一节 基本概念和原理
阴性。 （3）、体外传代细胞系最好选用已失去二倍体核
型，已获无限生长能力，但仍保持接触抑制而无致 瘤性的细胞系。
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三、目前常用的细胞种类
(一)原代细胞：动物细胞以叙利亚幼地鼠和金 黄色地鼠胚胎纤维细胞或幼地鼠肾细胞为佳 ； 人源细胞取自胚胎、小儿包皮及成人真皮纤 维细胞和淋巴细胞等 。
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四、细胞转化的基本过程
１.诱发(Initiation)阶段 ２.DNA的损伤与修复阶段
３.“转化灶”的产生
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１.诱发(Initiation)阶段
诱变剂直接接触细胞 （6小时以上最高不超过24 小时），诱变剂种类多如：
物理因素：如放射线、温度、电磁波、药物等 化学因素：如甲基胆蒽、土醌80、7.12—二甲基
诱变处理和转化阶段
传代所需倍增代数
用致癌剂处理
1
DNA突变的固定和表达
6
筛选和突变克隆形成（转化灶）
12
克隆生长达2×106细胞（克隆扩大培养）
12
传代、克隆再生长，以备研究需要
2
克隆化（纯化） 冻存
24 共57代（约三个月）
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二、转化灶的分离
1、刮除法(1)先在有转化灶的瓶壁上用记号笔圈出记号，倒 掉培养基。
(3)用完全培养基混匀沉淀细胞接种，37℃ 5% CO2培养。数日后， 转ห้องสมุดไป่ตู้细胞迅速增殖成新的细胞群。
转化：只是遗传特性、生长特性、生物学性 状改变，但无致瘤性
恶变：是细胞癌性变，有致瘤性
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三、细胞转化的方式
１．细胞自发转化：体外培养的细胞在无任 何诱变剂存在的条件下，细胞自发出现的转 化现象。
２．人工诱发转化(人工诱变)：在体外培养的 细胞中，常因化学、物理和生物等各种致癌 因素的影响，而使细胞发生转化，转化周期 大大缩短 ，转化率高。
NO1658)； 6、Rat-1； 7、PC-12（ATCC、CRL、 NO1721）； 8、CHO细胞系；9、V79细胞系
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第三节 细胞的转化和转化灶的分离 纯化
本节内容: 一、细胞的转化 二、转化灶的分离 三、转化细胞的筛选
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一、细胞的转化
表１２-１ 诱发突变细胞的细胞转化过程
苯醌(DMBA)、3-甲基胆蒽、甲基甲磺醌(MMS)、 乙基甲磺酸(EMS)、乙基亚硝基脲(ENC)、甲基硝 基亚硝基胍类化合物等； 生毒物、因多素发，瘤如病毒毒素(P、oli黄om曲a)霉、素逆、转病病毒毒S等V40、EB病 促癌剂(Promotor) ：如TPA
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２.DNA的损伤与修复阶段
(5)成单层后，再用消化传代法进行扩大培养。
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2、加套消化法(1)先在瓶壁上用记号笔圈出转化灶，弃掉瓶内培 养液，选生长状态良好的转化灶，用小不锈钢环或玻璃环或硅橡 胶圈，沾少许无菌明胶(不用亦可)套在转化灶上。
(2)向圈中滴入0.25%胰蛋白酶充分消化后，用弯头吸管把胰蛋白 酶与细胞一同吸出，加入3倍新鲜完全培养基混合后，立即低速离 心弃上清。
人胃上皮细胞 人淋巴细胞
适宜用SV40病毒转化； 适宜用EB病毒转化；
地鼠肾细胞
适宜用多发病病毒(Polioma)转化；
C3H小鼠胚纤维细胞 适宜化学致癌物转化。
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二、细胞的选择
选用细胞的原则为： （1）、体外容易培养和传代，克隆形成率高，并
能建立细胞系。 （2）、细胞本身无自发转化能力，动物致癌试验
修复过程中发生修复错误，引起DNA结构的 改变，细胞发生了遗传性改变。
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３.“转化灶”的产生
进入转化发展阶段的细胞仅是一小部分(大约5%左右)，这 些细胞称为癌前细胞(Precancerous Cell)，均散在未受损 伤的细胞中，随着细胞的继续培养，那些未受损伤的正常 细胞由于接触抑制的限制而停止运动，细胞分裂消失，但 那些散在的癌前细胞由于失去了接触抑制，加上生长繁殖 速度变快，而进行持续不断的分裂增殖，由于在局部癌前 细胞的数量增多而堆积，呈厚厚的多层排列，最后形成了 明显可见的“转化灶”(Focus)，常见有灰白细胞堆积中心点 和放射排列的灶（见书后照片）
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(二)传代细胞系 1、C3H/10T1/2(ATCC、CCL、NO226) 2、3T3-Swiss albsho(ATCC CCL NO92) 3、BALB/3T3(ATCC CCL NO163)等 4、BHK21(ATCC CCL NO10) 5、NIH/3T3-Swiss Mouse(ATCC、CRL、
(2)再用胶皮刮(或用加热的微型电烙器具)在倒置显微镜下去 除未发生转化的圈外正常细胞。
(3)向瓶内加入PBS洗去刮下的细胞，再用0.25％胰蛋白酶 (或0.05％胰蛋白酶-0.02％EDTA1:1混合)置室温消化。
(4)待被消化的细胞略有松动时，翻转瓶底，继续消化，至细 胞松散时，弃去消化液，加入新鲜的10%小牛血清的培养基， 中止消化，并反复用吸管吹打分散，制成细胞悬液，分瓶培 养。
本节内容: 一、细胞转化的基本概念 二、细胞转化与恶变的区别 三、细胞转化的方式 四、细胞转化的基本过程
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一、细胞转化的基本概念
细胞转化是细胞发生遗传性改变而导致细胞 永生化的转变方式，由限定性细胞系转变成 连续性传代细胞系，获得了永生化。
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二、细胞转化与恶变的区别