C. Sephadex G-150（分级范围， 5,000-400,000 D）
凝胶粒度的影响

凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。一般来说，细粒凝胶柱 流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于精制分离或分析等。粗粒 凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于粗制分离，脱盐 等。 在一般柱层析中，使用干颗粒直径在70μ m左右较合适。对于在水中 保存的凝胶如琼脂粉凝胶颗粒直径应在150μ m左右。凝胶颗粒大小 要均匀，这样流速稳定，效果较好
层析柱 （ a ）自制简易层祈柱（ 1 ．玻璃 管；2.橡皮塞；3．尼龙网）； （b）普通商品柱； （c）双底板层析柱（1.洗脱液进 出口； 2. 多孔底板； 3 ．柱床； 4 ．恒温水进口； 5 ．恒温水出口； 6．可调节的塞子）
4、样品的准备

样品的粘度：粘度大产生介质吸附， 一般要求样品粘度小于0.01Pa· s

选择凝胶时，应使样品中大分子组的分子量大于其排阻限，而小 分子组的分子量小于渗入限。也就是说大分子的分配系数Kd=0， 小分子的Kd＝1。这样能取得最好的分离效果。
例题：从某蛋白质溶液（MW=5500D）中除去无机盐，应选择下 列哪种凝胶最合适？
A. Sephadex G-15（分级范围， <1,500 D） B. Sephadex G-25（分级范围，1000-5000 D）
凝胶过滤层析
定义

凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种。 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离物 质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻层 析（size exclusion chromatography）、分子筛层 析（Molecular Sieve Chromatography）、凝胶渗 透层析（Gel Permeation Chromatography）

内水体积(Vi)是指凝胶颗粒中孔穴的体积。
基质体积(Vg)是指凝胶颗粒实际骨架体积。 柱床体积(Vt)就是指凝胶柱所能容纳的总体积。 洗脱体积(Ve)是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积
凝胶层析柱各种体积示意图（阴影部分）
分配系数（Kd）

每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个特定的分配系数
应用

凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多 肽、激素、多糖、核酸类等物质。
分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一 凝胶床就可以完全将它们分开。 利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液 进行脱盐、去热源和脱色。


原理

凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每 个颗粒犹如一个筛子。
带网孔的 葡聚糖珠

对生物样品来说，经常遇到的是两种分离形式。一种是只将 分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作类 分离或组分离。另一类则是要将分子量相差不很大的物质加 以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分离。后 者对实验条件和操作要求都比较高。
类分离

目的是分开样品中分子量悬殊的“较大分子组”和“较小分子组” 两类物质，并不要求分离分子量相近的组分

特点：与被分离物质分子的大 小和凝胶颗粒孔隙的大小有关
Байду номын сангаас
Kd=0 0＜Kd<1 Kd=1
大分子量 小分子量
洗脱体积
典型的凝胶类型


交联葡聚糖凝胶：Sephadex������ 丙烯葡聚糖凝胶：Sephacryl ������ 琼脂糖凝胶：Sepharose和Bio-Gel������ 其它：有机凝胶Sepharon，交联聚醚 Toyopeal，纤维素凝胶，改性刚性填料等
凝胶过滤层析实验技术
1、凝胶的选择
2、凝胶的预处理 3、装柱
4、样品的准备
5、上样
6、洗脱和收集
7、凝胶的再生及保存
凝胶过滤层析实验技术
1、凝胶的选择

选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的最根本的保证。选取 何种凝胶及其型号、粒度，一方面要考虑凝胶的性质，包括 凝胶的分离范围（渗入限与排阻限）、理化稳定性、强度、 非特异吸附性质等。

同一流速下不同粒度的Sephadex G-25柱的洗脱效果
2、凝胶的预处理


溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸泡24 小时以上或将干胶加入水里，边加边搅，然后放到 沸水浴中加热接近100℃，保持数个小时。根据干 凝胶的填充体积计算所需的干凝胶量 平衡：用起始缓冲液浸泡凝胶，直至凝胶液pH与起 始缓冲液相同（使凝胶溶胀状态稳定）
3、装柱



一般选用细长的层析柱作凝胶过滤。进行类分离（如脱盐）时，柱高 50cm比较合适；分级分离时，100cm较为合适 具体步骤为： 将层析柱垂直固定，一般是先在柱内装入约1/3高度的水或缓冲液排走空 气； 将平衡好的凝胶搅匀，连续倾入柱中，待其自然沉降至1/4-1/3高时打开 下端出口，让溶剂慢慢流出，继续倒入凝胶至沉降到所需高度。 用3-5倍柱床体积的起始缓冲液走柱，使凝胶介质充分平衡，柱床稳定 （若第一步采用起始缓冲液排空气则该步骤略）。
小分子进入 葡聚糖珠内

当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子 质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔 隙，随着溶剂流动，首先流出层析柱；
相对分子质量较小的物质可自由地进 出凝胶颗粒的网孔，使流量增长，移 动速率慢而最后流出层析柱。 中等大小的分子在大分子物质与小分 子物质之间被洗脱。 这样，经过层析柱，混合物中的各物 质按其分子大小不同而被分离。


大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出

固定相（凝胶）

三维空间网状结构
小分子
样品
分子筛效应： 按分子大小不同,在凝胶受到的阻滞 作用有差异,从而造成各组分在凝胶柱 中的迁移速度不同得到分离。
小分子 被延滯
固 定 相
流 动 相 大分子
较快流出
基本概念

外水体积(Vo)是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒 间液体流动相的体积。
Ve=Vo+KdVi
(1)Ve = Vo，Kd = 0 分子完全被排阻于凝胶颗粒之外 全部分布于流动相里 最先流出 (2)Ve = Vo + Vi，Kd = 1 分子完全不被排阻 完全向凝胶颗粒内部扩散 在两相分配的比值为1,最后流出 (3) 0 <Kd <1，Ve = Vo +ViKd 为溶质以某种程度向凝胶颗粒内扩 散