工作范围 （肽与蛋 白）D
<700
<1500
<5000
150020000
300070000
4000150000
Sepharose：琼脂糖凝胶 Bio-Gel A
15.0
5000300000
20.0
5000500000
Bio-Gel P：聚丙烯酰胺凝胶分子筛
Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝 胶
注2:数字显示光吸收A读数(可变量程读数模式)
当A量程开关选定在0-1.0A档时，此时数显板上显示 和读数即为光吸收A的实际读数，如显示为080即表示 为0.80A。
当A量程开关切换在其它量程位置时，则数显光吸收 A读数为:
A量程选定在0-2.0档时，数显读数×2=实际光吸收读数 A
A量程选定在0-1.0档肘，数显读数×1=实际光吸收读数 A
（三）凝胶柱的平衡
通过2-3倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定，然后在凝胶 表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防将来在加样时凝 胶被冲起，并始终保护凝胶上端有一段液体。
（四）加样
1.准备好部分收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪
2.打开柱上端的螺丝帽塞子，吸出层析柱中多余液体直 至与胶面相切。沿管壁将细胞色素C样品溶液5mL小 心加到凝胶床面上，应避免将床面凝胶冲起，打开下 口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当 样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子。按加样 操作，用1mL洗脱液冲洗管壁2次。最后加入3－4mL 洗脱液于凝胶上，旋紧上口螺丝帽，柱进水口连通恒 压瓶，柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相 连，比色池出液口再与自动部分收集器相连（如图）。 （五）洗脱
Kd=0 Kd=1 0<Kd<1 Kd>1
优点：
a. 条件温和 b.操作简便 c. 损失少回收率高 d. 层析 柱可反复使用
凝胶的类型：
Sephadex: 交联葡聚糖
G-10
G-15
G-25
G-50
G-75
G-100
G-150
G-200
吸水量
1.0
1.5
2.5
5.0
7.510.0来自（g/g干凝 胶）2．定位，
将“顺/逆”键置于“顺”或“逆”状态，按“手 动”键，使试管架转至终点，这时报警器工作，报 警指示灯亮，然后将“顺/逆”键置于“逆”或 “顺"状态，本仪器就会自动地对准第一个试管(在 “顺"状态，第一臂试臂为最内的那根。在"逆"状态， 第一臂试管为最外的那根)。如滴管口没对准第一 根试管只要松开换节臂调整螺钉，使滴臂口对准第 一根试管即可。
6、上述5个步骤结束后，就可以在层析柱上加样。当 样品经层析柱分离，通过检测后，就能通过记录仪 给出所需样品吸收的图谱。
7、测试完毕，必须切断电源，并用蒸馏水清洗样品池 和尼龙管。
注l:记录仪光吸收A读数
当采用l0mV量程记录仪时，记录仪的满量程读数对应 于A量程开关所对应的A读数范围。如A量程开关选定 在0-0.5A时，则记录仪满量程光吸收A读数为0.5，当 记录笔指示在记录纸一半 (50%刻度)位置时即为0.25A。
（二）装柱
1.装柱前，必须用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将 凝胶上面过多的溶液倾出。
2.先关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/3柱容积的 洗脱液，然后边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾入 柱中，使其自然沉降，等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱 的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉集，待沉集 的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭 出水口。
实验十 凝胶过滤层析纯化 细胞色素C
一、目的要求
1.学习和掌握凝胶过滤层析分离蛋白质的 原理与方法。
2.通过凝胶过滤柱层析对细胞色素C进行纯 化
二、原理
凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用 具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物 质的分子大小不同来进行分离。
Vt=Vo+Vi+Vg Ve=Vo+KdVi Kd=(Ve-Vo)/Vi
四、操作方法
（一）凝胶的选择与处理
1.凝胶及柱的选择 根据细胞色素C的分子量选择Sephadex G100。选用 1.5cm×60cm的柱子。
2.凝胶的处理 凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水 或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻 出去。自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在 沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达 到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。
洗脱收集
部分收集器、核酸蛋白检测仪
凝胶的保存方法
0.02%叠氮钠或0.002%洗必泰
应用
a. 分离蛋白质 b. 脱盐 c. 蛋白质分子量的测定
三、仪器的使用－核酸蛋白检测仪及 部分收集器的操作方法
记录仪
1、在仪器使用前，首先检查检测器，电源和记录仪 三部份电路连接是否正确，插上电源插头。
2、接通记录仪电源开关，使电源开关拔到“通”指 示灯亮。记录仪有两档走纸速度，每小时3厘米和 每小时12厘米，可根据记录仪说明书调换不同的 走纸速度。
3、将波长旋钮旋到所需波长刻度上，把量程旋钮拔 到100％T档。
4、按下ON电源箱面板上的电源开关，此时记录仪 指针从零点开始向右移动某一刻度，调节“光量” 旋钮使指针停留在记录仪大约中间位置5mV左右数 字显示为50左右。仪器开机稳定时间大约在1小时 左右，待基线平直后，可加样测试。
5、把检测器进样口塑料管接到部份收集器上，使层析 柱中的洗脱液通过。透光率为"0"厂家巳调好，光密 度A要调零，量程开关拔到100％T，调节光量旋钮， 使记录仪指针在100mV数字显示为100，即透光率为 100%。把量程开关拔到“A"挡，缓慢调节A调零旋 钮，使记录仪指示在"0"位，数字显示为“0"。
凝胶及柱的选择
•凝胶的处理及装柱
凝胶干粉的溶胀（热溶 胀）、浮选、抽气、装 柱、蓝色葡聚糖检查、 平衡
装柱时要注意操作压。
装柱的两种方法：
a.手工操作
1/3床体积水→加入少许凝胶积起1-2 厘米凝胶床→打开出水口→连续缓慢 加入凝胶
b.电动搅拌下的装柱法
（如图4-9）
样品上柱
分析用量：柱床体积的1—2% 制备用量：柱床体积的20—30%
部分收集器的操作方法
1．将“手/自”框内的键置于自动状态，按“定”和 “停”;使定时时间为零，放开“停”按“快”或 “慢”(“定”仍按着)至所需的定时时间，放开"慢" 和“定”，再按一下"停"设定定时时间工作就完毕。 若要查看设置时间，则只需按一下“定”键，就能 显示上一次所设时间，若要以秒显示走时时刻，则 需按下“秒”键。