深绿 绿色带蓝 蓝色带绿
紫蓝 青紫 深紫 深红 桔红 深黄 绿色带黄 Ultra-violet
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可见
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（3）光学因素的影响
散射是向空间各个方向，而使透射光 减弱。反射可使光能损失，当光线通过 两种不同介质时，则发生反射。当样本 溶液与空白溶液的折射率有较大差异时， 导致吸收值的偏差。
（4）非平行光通过吸收池时，由于光线 的倾斜使厚度L增大而影响测量值。
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2．影响因素
（1）化学因素的影响
溶液中溶质可因浓度的改变而发生离 解、缔合，与溶剂间的作用等原因而出 现偏离比尔定律的现象。由化学因素引 起的偏离，有时可控制溶液条件设法减 免。此外，能产生荧光的物质也可导致 偏离比尔定律。
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（2）非单色光的影响
比尔定律的一个重要条件是单色光， 但在比色分析中常有不同波长的光同时 存在。这就使吸光度发生改变，从而偏 离比尔定律。
生化检验技术基础 与进展
上海长征医院实验诊断科
于嘉屏
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一、比色分析
1．比色分析理论――Beer-Lambert 定律
A = lg（I0/I）＝KCL 或 I＝I0×10-KCL
I0：入射光强度 I：透过光强度 K：常数 C：溶液浓度 L：溶液的厚度
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2
（1）郎伯定律
I0
It
l
L
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4
透光率（transmittance，T，透射率） T＝I / I0
吸光度（absorbance，A） 光密度（eptical density，D或OD）
A＝lg I0/I＝-lgT T＝10-A＝10-KCL A＝KCL 当L用cm，C用mol/L表示，则K即称之为 摩尔吸光系数，用ε表示。 当C＝1mol/L，L＝1cm，则ε＝A。
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透光率（T）
吸光度（A）
－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－
1
0.000
0.75
0.125
0.5
0.301
0.25
0.602
0.17
0.770
0.1
1.000
0.05
1.301
0.01
2.000
0.001
3.000
－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－
白蛋白+溴甲酚绿 pH4.2 白蛋白溴甲酚绿复合物
引起在波长630nm范围内吸光度的上升, 与白蛋 白含量成正比
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二、分光光度计
1．光源
热光源: 钨灯、卤钨灯（320～2500nm）
气体放电光源：
氢灯、氘灯（185～375nm）。 氘灯发光强度比氢灯强3～5倍，是目前 紫外光区常用光源。
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2. 单色器
单色器是一种用来把光源发出的复合光分 解成单色光，并能任意改变所需波长的装置。
(1)棱镜 玻璃棱镜的折射率大、色散能力也大，因 而分辨本领高。但它吸收紫外光，因此只适 用于350～3000nm的波长范围。 石英棱镜对紫外光吸收少 ，适用于1954000nm间分光。但由于石英棱镜折射率低 于玻璃，因而色散能力差。
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3．比色法的误差
（1）仪器误差 滤光片，狭缝过宽，光电池疲劳，
仪器结构，散热不良。 （2）方法误差 （3）操作误差
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比色法举例
1. 总蛋白(TP)
蛋白质中的肽键+Cu 2+ 碱性条件 紫红色络合物
引起在波长540~560nm范围内吸光度的上升, 与 总蛋白含量成正比
2. 白蛋白(ALB)
H2O
尿素
尿素＋H2O 脲酶 2NH4+＋CO2 NH4+＋α-酮戊二酸＋NADH 谷氨酸脱氢酶
谷氨酸＋NAD+ ＋H2O
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肌酸激酶（CK）
磷酸肌酸＋ADP CK 肌酸＋ATP 葡萄糖＋ATP HK 葡萄糖-6-磷酸＋ADP 葡萄糖-6-磷酸＋NADP G6PDH
6-磷酸葡萄糖酸＋NADPH＋H+
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三、酶法分析
酶法分析包括两方面的内容： ①借助酶来测定某一化合物的浓度， 如测定体液中的葡萄糖、甘油三酯、胆 固醇、尿素、尿酸、肌酐等。 ②借助酶来测定另一种酶的活性，实 际上是用酶来测定待测酶的产物，如转 氨酶、肌酸激酶、淀粉酶等。
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葡萄糖
葡萄糖＋O2＋H2O 葡萄糖氧化酶 葡萄糖酸＋H2O2 H2O2＋苯酚＋4-氨基安替比林 过氧化物酶 醌亚胺＋
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8
波长的选择
波长(nm) 750~800 610~750 595~610 580~595 560~580 500~560 490~500 480~490 435~480 400~435 200~400
颜色 深紫 深红 桔红 深黄 绿色带黄 暗绿 绿色带蓝 蓝色带绿 紫蓝 青紫 紫外
被测溶液颜色
丙氨酸氨基转移酶（ALT）
丙氨酸＋α-酮戊二酸 ALT 丙酮酸＋谷氨酸 丙酮酸＋NADH＋H+ LDH 乳酸＋NAD+＋H2O
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酶催化特点
•高度的特异性 •高催化效率 •作用条件温和
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酶的活性部位
•底物结合部位 •催化部位
-dI∝Idl， -dI＝aIdl， dI/I=-adl
积分
It
L
dI/I ＝ -a dl 得： ln(I0 / It)＝-aL
I0
0
将ln改为lg，则为：lg（ I0 / It）＝-0.434aL＝K’L
令lg（ I0 / It） ＝A，则A＝ K’L
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3
（2）比尔定律 A＝K”C
（3）郎伯-比尔定律 A＝KLC
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4．检测器
在分光光度计中，把光信号转变 成电信号输出的装置称检测器。
光电池 光电管 光电倍增管
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双波长分光光度计
来自光源的光被两个单色器分别分离出 波长为λ1和λ2的两束单色光。经过折波器 后，两束波长不同的单色光交替地照射于 同一样品杯。样品杯背后的光电倍增管交 替地接收到两种波长照射吸收池后所产生 的信号。此信号经电子电路转化为两个吸 光度之差△A。
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(2)光栅
光栅是利用光的衍射、干涉原理制成的色 散元件。目前，全息光栅在质量上，成本上 都大大优于机械光栅。因光栅分光在紫外和 可见光区均适用，且色散力强、分辨率高， 故近年生产的分光光度计大都采用光栅作单 色器。
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3．比色杯
比色杯可由玻璃和石英等材料制成， 玻璃适用于350nm以上光区，而石英 杯则适用于紫外和可见光区。