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正由于以上原因，正确选择有机溶剂显得 十分重要。所以必须考虑以下几种因素： （ 1 ）溶剂与反应的相容性。例如，酶催化糖 修饰反应，必须在亲水性的有机溶剂（加二 甲基甲酰胺等）中进行。若使用疏水性有机 溶剂，底物不溶解，酶促反应不能发生。 （2）溶剂对主要的反应应该是惰性的。 （ 3 ）溶剂的密度、粘度、表面张力、毒性、 废物的处理和成本等。 但是普遍认为最佳溶剂因底物而异。 即一种溶剂在辛醇／水两相间分配系数 的常用对数值 (lgP)。 P大，酶活性大，所需 要的水量少。
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必需水：是维系酶构象稳定和酶催化活性所必需 的那部分最少量的水分子, 有时也叫结合水,或者束缚水。 只要那部分必需水不丢失, 其他的大部分水可 以由有机溶剂代替.
所以，有机介质中的酶促反应在微观上看是 水的酶反应，但是在宏观上看是有机介质中的酶反 应。如有的酶反应即使水只占0.015%， 酶仍然有 活性，可以进行酶反应, 而且反应速度非常快。
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五、 溶剂的选择
1.水溶性有机溶剂 甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、甘油、正丁醇等 2.水不溶性有机溶剂 石油醚、三氯乙烷、乙酸乙酯、苯、己烷等 在这些酶反应溶剂的选择中，介质的组成一般 可有四种：
1）单相共溶剂系统（水与能与水相溶的有机溶剂） 2）双相溶剂系统（水与跟水不相溶的有机溶剂） 3）低水有机系统 4）反向微团系统
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二、 活性
a)单相共溶剂系统中 对酶的影响作用主要是如下： 1) 有机溶剂直接作用于酶，破坏维持酶活性构象 的氢键、疏水键、水化层，酶变性失活。 一般有随着有机溶剂浓度上升,活性下降的一般规 律。 2)但有些酶，有机溶剂的浓度上升，酶活性反而上 升，到一定浓度， 酶活性达最高，如再提高浓度， 酶活性反而下降。 如胰蛋白酶在1,4-丁二醇中最适浓度80%猪心线 粒体ATPase，在乙醇中最适浓度10% EcoRI内切 酶在甘油中最适浓度为20% 37
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二、必需水含量问题：
一般因酶分子本身, 或溶剂系统不同而有所不同。 如脂肪酶有几个水分子, 胰凝乳蛋白酶几十个水分子, 乙醇脱氢酶、多酚氧化酶有几百个水分子。 另外同一个酶在不同溶剂系统中含水也不同。 如胰凝乳蛋白酶，在甲苯中，含水0.5%； 氯仿等系统中，含水1.0%，酶活性最高。
一般酶要发挥它的催化活性，必须与有机溶剂系统获 得水分以维持酶必要的水合状态。
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在上面四种系统中，1---3用的多 原因是： 1）因为这几个系统容易建立 2）产物和酶容易回收 其中又以低水有机系统为好，因为适合 疏水的有机溶剂和耐高温（增加稳定性）。 缺点：扩散差，所以反应速度慢等。 克服的方法： 选用反向微团系统。
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那么，有机溶剂最终是如何影响酶反应的？ 一般解释有如下几种： 1）通过底物、产物在水相和有机溶剂中分配， 必然影响到底物、产物在酶必需水在水层中的 浓度，这样，自然影响到酶的反应速度。 2） 必需水对特定的酶是一定的。如果有机溶 剂与酶的必需水作用，夺取酶的必需水，一定 影响酶的活性。 如果是极性强的有机溶剂，夺取酶的必需 水就多，酶就可能最终失活。 如果是一般的有机溶剂，夺取酶的必需水 不明显，就最适合酶在这类有机溶剂中反应。
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有一个例子十分明显。 胰凝乳蛋白酶，在辛烷中的反应速度比吡啶 中 快104倍。酶活性随着疏水性增加而增加。 3）有机溶剂本身的影响。 (1)有机溶剂使底物基态能级下降或使酶-底物复 合物能级升高，从而增大酶反应的活化能来降 低酶反应速度； (2)有机溶剂分子进入酶活性中心，降低活性中 心内部极性并加强底物与酶之间形成的氢键， 使酶活性下降； (3)有机溶剂侵人会造成酶的三级结构变化，间 接改变酶活性中心结构来影响酶活性。
第五章 有机溶剂中的酶催化反应
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第一节 非水介质中酶学基础
• 用于酶催化的非水介质包括：
– 含微量水的有机溶剂 – 与水混溶的有机溶剂和水形成的均一体系 – 水与有机溶剂形成的两相或多相体系 – 胶束与反ห้องสมุดไป่ตู้束体系 – 超临界流体 – 气相
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非水介质中酶的结构
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有机介质中的酶促反应的优越性
原先的认识： 1）我们以前的酶学理论知道，酶溶解在水溶液中， 而且酶一定是在水溶液中才能反应，又知道水是 个极性分子，酶只能在极性溶剂中反应。 2）我们又知道有机溶剂是酶的变性剂，用了以后， 应该在尽可能短的时间内去除有机溶剂，再把酶 溶解于水中，以防止酶的变性和失活。
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酶是否适于在有机介质中反应，除 与酶性质有关外，还取决于酶-底物、产 物-溶剂间的关系问题。 这完全需要用实验来决定。
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四、 酶形式的差别
酶在有机介质中的溶解特性、稳定性、活性等，对酶 的选择很重要。
1）酶00000000粉
将酶做成冻干粉，然后在有机介质中充分搅拌，超声波 处理，使得颗粒变小，悬浮于介质中。
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第二节 反应条件： 一句话，条件要适宜,在一个特定条件下进行，。 一、 保证必需水含量 水是保证酶催化反应的必需条件，活性构象 是水分子直接或间接由氢键等非共价键相互作用来 维持。 因此与酶分子紧密结合的一单层水分子对催 化作用非常重要。而其他的水则相对不那么重要 (即由有机介质替代的那部分水不那么重要了）。
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一、 酶的稳定性问题
1）一般被认为酶更加稳定，因为对热的稳定性提高。 如猪胰脂肪酶在醇和酯中进行反应，100℃温度下反 应,半衰期12小时以上, 活性比25℃时高好几倍。 胰凝乳蛋白酶在60℃水中，几分钟就会有失活。 而在辛烷中，半衰期有几个小时。 2）存储酶的存储稳定性提高 胰凝乳蛋白酶20℃的水中，半衰期只有几天。 而在辛烷中，半衰期有6个月，活性全部不损失。
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六、 pH的选择问题：
因为在有机介质中的最适pH与水溶液中 的最适pH的酶反应是一样的，所以在进行酶 的冻干时，可以在最适pH的缓冲液中冻干出 来，再进行有机系统的反应。 这样，可以使酶在有机溶剂中反应的微环境 具有溶液酶的最适pH环境。
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第三节 有机介质对酶反应的影响
总起来讲基本上遵循米氏方程的动力学。 但也有一些影响。
现在酶工程技术的发展，已经告诉我们，酶 反应可在有机介质中进行，已经成为酶工程、酶 化工研究的一个新的领域，开辟了一个新的研究 方向。
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有机介质中酶促反应优越性被认为至少有以下优点：
1）有利于疏水性底物反应 2）提高酶反应T，加速反应V，提高酶反应稳定性。 3）可以催化一些在水相中不能进行的反应。 4）可以改变反应的平衡方向。 5）控制底物的专一性。 6）防止由水引起的付反应。 7）扩大反应的pH范围. 8）有利于酶的固定化。 9）酶、产物容易回收。 10）消除底物、产物的抑制作用。 11）防止微生物的污染。
2）控制酶量的问题
需要适量。如α-凝乳蛋白酶在乙醇中的转脂反应，随着加 酶量的下降，活性反而上升，速度快。 可能理由： 被认为在水含量不变的情况下，酶少到一个合适的浓度， 可以使酶聚合体变小，反而增大了酶-底物接触的面，减 少了底物扩散的限制，酶反应速度反而加快。 14
3）酶化学修饰的问题
化学修饰可以改变酶的一些理化性质， 有利于酶在有机溶剂中的稳定性，原先不稳 定的酶经过修饰变得稳定，主要是因为改变 了酶的一些理化性质。
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下面是一个胰脂肪酶的反应速度---水含量的关系 图。
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一般认为，一个酶结合水的过程分4步： 1.首先与酶分子表面的带电基团结合一部 分水(0- 0.07g/g(水/酶))。 2.再与酶分子表面的极性基团结合一部分 水(0.07-0.25g/g(水/酶))。 3.再聚集到表面相互作用较弱的部位 (0.25-0.38g/g(水/酶))。 4.最后酶分子表面完全水合化，水分子覆 盖酶分子表面。
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另外载体问题还会影响酶的动力学。 如影响一个酶同时催化两个反应的相对速度。 在低水活度下把胰凝乳蛋白酶固定在聚酰胺载 体AccureI PA6上，水解反应被抑制，却有利于醇解 反应进行。这是固定化后发生的另外一种情况。 一般来说，载体要选择疏水性基质，目的是为 了有利于在有机溶剂中反应。 如用具有高氧渗透性的硅聚合物比较好。 用固定化材料，还应考虑载体的酶负载量、颗 粒大小、表面积、内部孔径大小、酶与载体间的相 互作用等。 这与前面固定化时讲的要求，出发点不一样。
一般认为大多数酶可以在有机介质中 反应。但是，操作稳定性差。化学修饰 的目的就是要提高酶的稳定性。
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化学修饰方法很多，聚乙二醇（PEG）修 饰较常见。 如PEG修饰过氧化氢酶，然后在有机介质 中活性显著提高。 还研制了磁性脂肪酶（磁性颗粒外包 PEG修饰的脂肪酶），它在有机介质中较稳定， 活力也较高，且可在磁场中回收。 还有用谷氨酸、十二醇、葡萄糖酸内酯 合成了糖脂后修饰超氧化物歧化酶（SOD）。 所得的这种SOD糖脂复合物变成脂溶性的酶， 而不是水不溶性的。SOD糖脂复合物在有机介 质中活性高大大高于在水中的活性，并且它对 温度、 pH、蛋白酶水解等的稳定性均高于天 16 然SOD。
其次，载体影响酶分子上的结合水。 亲水性高的载体会从溶剂和酶分子中夺取大 量的水，造成酶部分失水而降低酶的活性； 亲水性低的载体不足以夺取酶的必需水，能 保持它的高酶活性。 还有通过载体与酶之间形成的多点的 结合作用，可稳定酶的催化活性构象。例如， α-胰凝乳蛋白酶与聚丙烯酰胺凝胶共价结合 后，在乙醇中的稳定性明显提高，并且对有 机溶剂的抗性随酶与载体间共价键数量的增 加而增强。
还有用聚磷酸酯、脂肪酸等修饰SOD， 同样得到了适合于有机介质中进行催化反应的 化学修饰酶--SOD。 在进行了不同化学修饰酶在有机介质中 的反应的研究以后，发现化学修饰（采用脱糖 基化、 PEG 修饰等）能够增加酶的表面疏水 性，而疏水性的增加正是提高酶在有机介质中 的溶解性和活力的重要原因。 PEG 修饰酶在甲苯中的活性比未修饰酶 高 16 倍。通过酶蛋白甲基化作用或疏水分子 对酶蛋白的修饰，均可提高酶在有机介质中的 溶解性、稳定性和活性。